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双酶切连接转化后貌似出现自连
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我想克隆一个基因到表达载体PGEX-6P-2，该质粒大小5000，我的目的基因3000左右，连接前酶切产物检测了，大小正确，练接转化后，挑克隆，提取质粒，并单酶切检测大小，竟然是5000左右，感觉像自连，但双酶切应该不会发生自连，我用的两个酶是EcoI 和Not I，PCR扩增也没出来，如果没连上，应该菌不会找。求分析愿意，哪的问题，想了半天找不出来，谢谢！见图；第二个图，第一个带，是质粒双酶切，2为，目的基因双酶切，3转化后，挑克隆，提取质粒单酶切，4是22000的Marker 123.JPG  456.JPG |
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4楼2013-06-13 16:08:15
cicelyzh
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【答案】应助回帖
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| 载体自连说明双酶切载体时酶切不完全，虽然切成线性分子，但是载体双酶切的带和单酶切的带几乎一样大，很难分辨的。你的情况很可能是其中的一个酶切得不好。你做双酶切载体的同时最好分别做两个酶的单酶切对照，酶的用量要根据酶活性和质粒的用量来加。 |
2楼2013-06-13 12:53:18
gzl9901
铁杆木虫 (文坛精英)
very good
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