应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切转化之后不长菌
51/1返回列表
查看: 1632  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zpsl1986

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切转化之后不长菌

求助大家，我构建载体，用的BamHI 和XbaI双酶切，载体大小10000bp，基因大小1000bp，酶切连接之后转化，转化几次都不长菌，做的对照正常，说明转化没有问题，平板的抗性也没问题，看网上说XbaI受甲基化影响，我用的是top10的大肠杆菌感受态，不知道跟甲基化有什么关系。希望大家给分析一下！不胜感激！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-11-04 10:48:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eulota

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-07 16:41:46
我最近正好刚刚用这两个酶做双酶切连接构建，一切很顺利，几乎都是阳性克隆。
我用的是酶是NEB的。lz说的比较含糊，这个是常规技术，双酶切连接理论上成功率是相当高的。没有太多可说的，2个建议仅供参考：
1. 酶切问题，你是怎么得到酶切处理后的片段和载体的呢？如何确保你得到酶切处理成功了呢？双酶切的缓冲液是否正确呢？
2.连接问题，你是如何做的连接反应呢？是否可改进？比如4度过夜，或者16度超过4小时？
赞一下 回复此楼
4楼2013-11-07 09:40:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答

oylb

禁言 (正式写手)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-04 16:04:06
本帖内容被屏蔽
2楼2013-11-04 11:32:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zpsl1986

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by oylb at 2013-11-04 11:32:01
应该是连接效率的问题，或者其他的潜在可能，比如PCR产物是否为目的片段（有可能为假阳性）、PCR产物末端的保护碱基是否合适，等等。

我以前用过这个载体，也出现这样的问题，当时一个板上就长了那一个菌，结果还是阳性。连接效率问题的话，多加点连接酶可以吗？
赞一下 回复此楼
3楼2013-11-04 15:27:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shanqian1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-07 16:41:55
估计连接酶的问题吧，我遇到过这种情况，换连接酶就好啦
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2013-11-07 10:13:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 332求调剂 +5 Zz版 2026-03-13 5/250 2026-03-17 11:01 by JineShine
[考研] 275求调剂 +4 太阳花天天开心 2026-03-16 4/200 2026-03-17 10:53 by 功夫疯狂
[考研] 化学工程321分求调剂 +10 大米饭！ 2026-03-15 13/650 2026-03-17 06:57 by laoshidan
[考研] 328求调剂，英语六级551，有科研经历 +3 生物工程调剂 2026-03-16 4/200 2026-03-16 20:13 by Wangjingyue
[考研] 333求调剂 +3 文思客 2026-03-16 7/350 2026-03-16 18:21 by 文思客
[考研] 0854控制工程 359求调剂 可跨专业 +3 626776879 2026-03-14 9/450 2026-03-16 17:42 by 626776879
[考研] 304求调剂 +3 曼殊2266 2026-03-14 3/150 2026-03-16 16:39 by houyaoxu
[考研] 311求调剂 +5 26研0 2026-03-15 5/250 2026-03-16 16:21 by a不易
[考研] 070300化学学硕求调剂 +6 太想进步了0608 2026-03-16 6/300 2026-03-16 16:13 by kykm678
[考研] 070303 总分349求调剂 +3 LJY9966 2026-03-15 5/250 2026-03-16 14:24 by xwxstudy
[基金申请] NSFC申报书里申请人简历中代表性论著还需要在申报书最后的附件里面再上传一遍吗 20+5 NSFC2026我来了 2026-03-10 14/700 2026-03-15 23:53 by 不负韶华的虎
[考研] 机械专硕调剂 +3 笨笨兔子 2026-03-12 3/150 2026-03-15 20:02 by 栗子粥?
[考研] 求调剂（材料与化工327） +4 爱吃香菜啦 2026-03-11 4/200 2026-03-13 22:11 by JourneyLucky
[考研] 290求调剂 +9 ADT 2026-03-11 9/450 2026-03-13 21:55 by JourneyLucky
[考研] 工科，求调剂 +3 我887 2026-03-11 3/150 2026-03-13 21:39 by JourneyLucky
[考研] 329求调剂 +3 miaodesi 2026-03-12 4/200 2026-03-13 20:53 by 18595523086
[考研] 考研调剂 +4 芬达46 2026-03-12 4/200 2026-03-13 16:04 by ruiyingmiao
[考研] 材料301分求调剂 +5 Liyouyumairs 2026-03-12 5/250 2026-03-13 14:42 by JourneyLucky
[考研] 333求调剂 +3 152697 2026-03-12 4/200 2026-03-13 07:08 by Iveryant
[考研] 求调剂材料专硕293 +6 段_(:з」∠)_ 2026-03-10 6/300 2026-03-10 18:22 by ms629
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭