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zpsl1986

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切转化之后不长菌

求助大家,我构建载体,用的BamHI 和XbaI双酶切,载体大小10000bp,基因大小1000bp,酶切连接之后转化,转化几次都不长菌,做的对照正常,说明转化没有问题,平板的抗性也没问题,看网上说XbaI受甲基化影响,我用的是top10的大肠杆菌感受态,不知道跟甲基化有什么关系。希望大家给分析一下!不胜感激!
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eulota

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-07 16:41:46
我最近正好刚刚用这两个酶做双酶切连接构建,一切很顺利,几乎都是阳性克隆。
我用的是酶是NEB的。lz说的比较含糊,这个是常规技术,双酶切连接理论上成功率是相当高的。没有太多可说的,2个建议仅供参考:
1. 酶切问题,你是怎么得到酶切处理后的片段和载体的呢?如何确保你得到酶切处理成功了呢?双酶切的缓冲液是否正确呢?
2.连接问题,你是如何做的连接反应呢?是否可改进?比如4度过夜,或者16度超过4小时?
4楼2013-11-07 09:40:32
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oylb

禁言 (正式写手)

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-04 16:04:06
本帖内容被屏蔽

2楼2013-11-04 11:32:01
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zpsl1986

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by oylb at 2013-11-04 11:32:01
应该是连接效率的问题,或者其他的潜在可能,比如PCR产物是否为目的片段(有可能为假阳性)、PCR产物末端的保护碱基是否合适,等等。

我以前用过这个载体,也出现这样的问题,当时一个板上就长了那一个菌,结果还是阳性。连接效率问题的话,多加点连接酶可以吗?
3楼2013-11-04 15:27:57
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shanqian1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-07 16:41:55
估计连接酶的问题吧,我遇到过这种情况,换连接酶就好啦
5楼2013-11-07 10:13:13
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