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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酶切时间确定？
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feiye2214

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】酶切时间确定？已有4人参与

我想切片段的两端，一端是EcoR I一端是BamH I，反应时间是一样的，反应温度一个是37，一个是30，缓冲液一个是10×K，一个是10×H，但是两种在10×K下都有很高的效率，
我能不能把两种酶都放进去酶切，用的是10×K缓冲液，时间设定是30度一小时，37度一小时，共两个小时，然后再加10×loading buffer终止
这样可行？？还是要一个酶切之后，再酶切另一端？？
大侠帮忙
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1楼2010-08-10 18:55:51
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-11 07:47:39
可以~反正酶活性都是有的
不过不知道EcoR I切两个钟会不会有星活性
但要是质粒量够多也不怕
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2楼2010-08-10 19:07:31
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feiye2214

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-08-10 19:07:31:
可以~反正酶活性都是有的
不过不知道EcoR I切两个钟会不会有星活性
但要是质粒量够多也不怕

星活性啥意思，不懂请赐教
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3楼2010-08-10 19:22:01
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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amisking(金币+2):good！ 2010-08-10 21:02:10
引用回帖:
Originally posted by feiye2214 at 2010-08-10 19:22:01:

星活性啥意思，不懂请赐教

就是酶不去切它该切的地方，瞎切一气
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4楼2010-08-10 19:23:13
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
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哪个公司的酶？Fermentas？
可以上他们公司的主页，选择两个酶后submit后可以找到他们公司推荐的酶切体系。
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Thank-you，so-blue.
5楼2010-08-10 20:28:10
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-11 07:48:07
引用回帖:
Originally posted by feiye2214 at 2010-08-10 19:22:01:

星活性啥意思，不懂请赐教

在某些情况下（比如甘油浓度高，盐离子浓度不合适等等），内切酶的识别位点会发生松弛或变化，导致切割的特异性下降。

EcoRI切的时间过长比较容易产生星号活性，但是两个小时应该没什么大问题，尤其是前一个小时只是30度
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6楼2010-08-10 21:56:28
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feiye2214

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-08-10 20:28:10:
哪个公司的酶？Fermentas？
可以上他们公司的主页，选择两个酶后submit后可以找到他们公司推荐的酶切体系。

大连TAKARA的
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7楼2010-08-10 22:39:38
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-11 07:48:20
引用回帖:
Originally posted by feiye2214 at 2010-08-10 22:39:38:

大连TAKARA的

那没问题
我也做过TaKaRa的EcoRI和BamHI双酶切，用BufferK，30度2h+37度2h都做过，没问题
你样品里的DNA浓度要是不太高，时间可以短一点，1h就好，EcoRI还是尽量避免长时间切，尤其在bufferK里面
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8楼2010-08-10 23:17:37
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