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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 蓝白斑筛选挑取白色克隆用菌落PCR验证，除目的片段外还有一条带，什么原因？
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贤愚Libra

银虫 (正式写手)

[求助] 蓝白斑筛选挑取白色克隆用菌落PCR验证，除目的片段外还有一条带，什么原因？ 已有3人参与

如题，引物T7/SP6，目的片段大小为450bp。

蓝白斑筛选挑取白色克隆用菌落PCR验证，除目的片段外还有一条带，什么原因？
T7-SP6.jpg
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www------sr-------------
1楼 2014-08-10 09:37:09
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
贤愚Libra(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-10 10:29:08
我们也用你这种marker，看上去确实目的条带太弱了，反而700多的条带很亮。不知道你连接的片段多大，是不是连了两个进去？另外，电泳图上半部分很亮，不知道是不是紫外光没照均匀？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-08-10 10:03:37
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
贤愚Libra(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-10 10:28:56
虽然不知道你的marker的大小，但感觉你的扩增产物可能不是你的target，也许是些非特异性扩增？特别许多产物大小还不一致？是不是这两个引物配对不是太好还是扩增条件未优化？有无阳性对照？（两个引物不会是同方向的 吧？）
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2楼2014-08-10 09:48:46
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贤愚Libra

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-08-10 09:48:46
虽然不知道你的marker的大小，但感觉你的扩增产物可能不是你的target，也许是些非特异性扩增？特别许多产物大小还不一致？是不是这两个引物配对不是太好还是扩增条件未优化？有无阳性对照？（两个引物不会是同方向的 ...

T7/SP6是T载体上的通用引物，应该不是引物的问题，我的marker是100bp的marker,最上面是1500，往下以此是1000bp,900bp,800bp……，上面的600-700bp间的带是我的目的片段，下面400-500bp间的带是不该出现的带。
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www------sr-------------
3楼2014-08-10 10:01:35
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader
引用回帖:
3楼: Originally posted by 贤愚Libra at 2014-08-09 21:01:35
T7/SP6是T载体上的通用引物，应该不是引物的问题，我的marker是100bp的marker,最上面是1500，往下以此是1000bp,900bp,800bp……，上面的600-700bp间的带是我的目的片段，下面400-500bp间的带是不该出现的带。...

你不是说你的目的片段大小为450bp吗？
T7/SP6是测序引物吧，所以我怀疑这两个引物是否有可能都是正向（或反向）引物的可能性。
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5楼2014-08-10 10:06:15
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贤愚Libra

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-08-10 10:03:37
我们也用你这种marker，看上去确实目的条带太弱了，反而700多的条带很亮。不知道你连接的片段多大，是不是连了两个进去？另外，电泳图上半部分很亮，不知道是不是紫外光没照均匀？
...

不是的，上面亮的是我的目的片段（目的片段加载体部分序列），下面弱的是杂带。胶上部分亮可能是因为我将染料加到胶里的原因。
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6楼2014-08-10 12:15:59
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贤愚Libra

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-08-10 10:06:15
你不是说你的目的片段大小为450bp吗？
T7/SP6是测序引物吧，所以我怀疑这两个引物是否有可能都是正向（或反向）引物的可能性。...

我用的引物时T7/SP6，所以目的片段450加上载体部分序列后就是600多bp了。
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7楼2014-08-10 12:18:57
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 贤愚Libra at 2014-08-10 12:15:59
不是的，上面亮的是我的目的片段（目的片段加载体部分序列），下面弱的是杂带。胶上部分亮可能是因为我将染料加到胶里的原因。...

我开始理解错了，下面那些是非特异条带的话，优化一下PCR体系就会好了吧。目的条带那么浓，应该没关系的。
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8楼2014-08-10 12:22:55
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贤愚Libra

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-08-10 12:22:55
我开始理解错了，下面那些是非特异条带的话，优化一下PCR体系就会好了吧。目的条带那么浓，应该没关系的。...

但 我觉得也不应该是非特异条带吧 因为有的有有的没啊
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9楼2014-08-10 14:14:54
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 贤愚Libra at 2014-08-10 14:14:54
但 我觉得也不应该是非特异条带吧 因为有的有有的没啊...

大部分都有，你降低模板浓度，提高一下退货温度，扩增试试。
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10楼2014-08-10 14:30:46
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