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汕头大学海洋科学接受调剂
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贤愚Libra

银虫 (正式写手)

[求助] 蓝白斑筛选挑取白色克隆用菌落PCR验证,除目的片段外还有一条带,什么原因? 已有3人参与

如题,引物T7/SP6,目的片段大小为450bp。

蓝白斑筛选挑取白色克隆用菌落PCR验证,除目的片段外还有一条带,什么原因?
T7-SP6.jpg
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
贤愚Libra(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-10 10:29:08
我们也用你这种marker,看上去确实目的条带太弱了,反而700多的条带很亮。不知道你连接的片段多大,是不是连了两个进去?另外,电泳图上半部分很亮,不知道是不是紫外光没照均匀?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2014-08-10 10:03:37
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普通回帖

ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader


【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
贤愚Libra(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-10 10:28:56
虽然不知道你的marker的大小,但感觉你的扩增产物可能不是你的target,也许是些非特异性扩增?特别许多产物大小还不一致?是不是这两个引物配对不是太好还是扩增条件未优化?有无阳性对照?(两个引物不会是同方向的 吧?)
2楼2014-08-10 09:48:46
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贤愚Libra

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-08-10 09:48:46
虽然不知道你的marker的大小,但感觉你的扩增产物可能不是你的target,也许是些非特异性扩增?特别许多产物大小还不一致?是不是这两个引物配对不是太好还是扩增条件未优化?有无阳性对照?(两个引物不会是同方向的 ...

T7/SP6是T载体上的通用引物,应该不是引物的问题,我的marker是100bp的marker,最上面是1500,往下以此是1000bp,900bp,800bp……,上面的600-700bp间的带是我的目的片段,下面400-500bp间的带是不该出现的带。
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3楼2014-08-10 10:01:35
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader


引用回帖:
3楼: Originally posted by 贤愚Libra at 2014-08-09 21:01:35
T7/SP6是T载体上的通用引物,应该不是引物的问题,我的marker是100bp的marker,最上面是1500,往下以此是1000bp,900bp,800bp……,上面的600-700bp间的带是我的目的片段,下面400-500bp间的带是不该出现的带。...

你不是说你的目的片段大小为450bp吗?
T7/SP6是测序引物吧,所以我怀疑这两个引物是否有可能都是正向(或反向)引物的可能性。
5楼2014-08-10 10:06:15
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贤愚Libra

银虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-08-10 10:03:37
我们也用你这种marker,看上去确实目的条带太弱了,反而700多的条带很亮。不知道你连接的片段多大,是不是连了两个进去?另外,电泳图上半部分很亮,不知道是不是紫外光没照均匀?
...

不是的,上面亮的是我的目的片段(目的片段加载体部分序列),下面弱的是杂带。胶上部分亮可能是因为我将染料加到胶里的原因。
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6楼2014-08-10 12:15:59
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贤愚Libra

银虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-08-10 10:06:15
你不是说你的目的片段大小为450bp吗?
T7/SP6是测序引物吧,所以我怀疑这两个引物是否有可能都是正向(或反向)引物的可能性。...

我用的引物时T7/SP6,所以目的片段450加上载体部分序列后就是600多bp了。
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7楼2014-08-10 12:18:57
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 贤愚Libra at 2014-08-10 12:15:59
不是的,上面亮的是我的目的片段(目的片段加载体部分序列),下面弱的是杂带。胶上部分亮可能是因为我将染料加到胶里的原因。...

我开始理解错了,下面那些是非特异条带的话,优化一下PCR体系就会好了吧。目的条带那么浓,应该没关系的。
8楼2014-08-10 12:22:55
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贤愚Libra

银虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-08-10 12:22:55
我开始理解错了,下面那些是非特异条带的话,优化一下PCR体系就会好了吧。目的条带那么浓,应该没关系的。...

但 我觉得也不应该是非特异条带吧 因为有的有有的没啊
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9楼2014-08-10 14:14:54
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 贤愚Libra at 2014-08-10 14:14:54
但 我觉得也不应该是非特异条带吧 因为有的有有的没啊...

大部分都有,你降低模板浓度,提高一下退货温度,扩增试试。
10楼2014-08-10 14:30:46
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