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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蓝白斑筛选什么都没长，不是感受态的问题。真诚求助高手解答！
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coral8813

新虫 (初入文坛)

[求助] 蓝白斑筛选什么都没长，不是感受态的问题。真诚求助高手解答！ 已有1人参与

我昨天中午涂板做的蓝白斑筛选实验，今天早上一看什么都没长，培养了接近20个小时了。我做的阴性对照，在amp、IPTG、X-gal平板涂感受态什么都没长；阳性对照不加amp的LB平板涂上感受态，菌长成一片，而且感受态是我自己新做的，4度放置12-24小时使用的应该不会有问题。会是连接液的问题么？用的promega的PGEM-T载体，不过在冰箱放了有一年半载的了，但是应该问题不大吧。到底是怎么回事啊！上周做也是什么都没长，当时没做对照我以为是感受态的问题所以重新做的，用的氯化钙法。真不知道为什么失败，求助啊求助！
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YNWA!
1楼 2012-07-17 09:27:02
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回帖置顶 ( 共有2个 )

feitianrenwo

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
amisking: 金币+5, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-17 21:03:54
amisking: 回帖置顶 2012-07-17 21:03:56
建议你这样做：
1、转个PUC19：amp、 x-gal 、IPTG的板子
   验证你的感受太细胞是否有问题
2、空载体转化
   验证你的载体是否有问题

如果都没有问题就可以继续做下一步了


如果上面两个实验都不行，建议你买国外进口的amp 、 x-gal 、IPTG
其中x-gal 用DMF配，x-gal 和IPTG均要用锡箔纸包好避光，-20℃保存


希望能帮到你
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4楼2012-07-17 11:00:44
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zqx128

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2012-07-17 21:03:59
amisking: 金币+4, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-17 21:04:05
楼主的阳性对照长得很好说明不是感受态的问题，应该是连接的问题吧。其它可能原因：
1 感受态转化完复苏的时候加了含抗生素的LB培养基？我想楼主应该不会犯这么低级的错误吧。
2 抗生素浓度搞错？Amp的最大工作浓度用到100微克/毫升。

   另外，我觉得楼主在没有把所有的实验条件摸好之前一下做30个转化是个忌讳哦~
    祝尽快找到原因，实验顺利！
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6楼2012-07-17 11:39:36
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普通回帖

ZOEY21

金虫 (小有名气)
我的板子开始什么都没长是因为没调pH（话说国产试剂一定要调pH啊），
后来有段时间长了，再做就又没有了，刚换了新的感受态，还不晓得结果。希望楼主赶快找到原因。
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2楼2012-07-17 10:34:23
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coral8813

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ZOEY21 at 2012-07-17 10:34:23
我的板子开始什么都没长是因为没调pH（话说国产试剂一定要调pH啊），
后来有段时间长了，再做就又没有了，刚换了新的感受态，还不晓得结果。希望楼主赶快找到原因。

谢谢回答~我也用的国产试剂，配LB确实加了不少氢氧化钠才把ph调到7.2 应该不是这里的问题，所以我还是怀疑我的连接出问题了，具体步骤都是按说明书上来的，不知怎么搞得。你也注意下除了感受态是不是其他问题。。我下次一定少做点，这一次做了三十多过都没长太郁闷了。。
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YNWA!
3楼2012-07-17 10:43:52
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-18 13:50:38
应该不是药品的是，我们实验室都是用的国产的分析纯 IPTG X-gal用的生工的，配BL从来没用调过PH。没长斑，可以就是没连上，你目的条带大吗？大的话连T-vocter难些，我看你的T-vocter放了有1年半了？ 我们这里用的载体 包装上的保质期是6个月不知道你那个是几个月。放的时间长了，T载体效果就不好了，这个我试过。
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5楼2012-07-17 11:15:06
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coral8813

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by feitianrenwo at 2012-07-17 11:00:44
建议你这样做：
1、转个PUC19：amp、 x-gal 、IPTG的板子
   验证你的感受太细胞是否有问题
2、空载体转化
   验证你的载体是否有问题

如果都没有问题就可以继续做下一步了


如果上面两个实验都不行，建 ...

首先十分感谢~~现在这个载体用完了，我在想会不会是我的DNA不纯呢，我是做的DGGE割胶之后用索莱宝的聚丙烯酰胺凝胶电泳回收试剂盒回收的，pcr琼脂糖跑出来的电泳没有杂带，下图1；为了进一步纯化我又将其割胶再次用琼脂糖回收试剂盒回收，但是pcr电泳之后就有严重的拖尾了，下图2；所以我直接用的DGGE直接回收的DNA pcr之后连接的，会是这个问题么。。为什么回收之后反倒拖尾这么严重了，真是弄不清啊。。

dgge回收



琼脂糖回收
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YNWA!
7楼2012-07-17 15:20:23
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coral8813

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小虫子666 at 2012-07-17 11:15:06
应该不是药品的是，我们实验室都是用的国产的分析纯 IPTG X-gal用的生工的，配BL从来没用调过PH。没长斑，可以就是没连上，你目的条带大吗？大的话连T-vocter难些，我看你的T-vocter放了有1年半了？ 我们这里用的载 ...

没有放那么长时间，一共两包T载体试剂盒，但是剩的都不多，一个大概半年，一个有一年了吧，我把剩下的都用完了，都没长出来。。我的片段很短200bp左右。我还是再买新的试试吧，thank you！
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YNWA!
8楼2012-07-17 15:23:28
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coral8813

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zqx128 at 2012-07-17 11:39:36
楼主的阳性对照长得很好说明不是感受态的问题，应该是连接的问题吧。其它可能原因：
1 感受态转化完复苏的时候加了含抗生素的LB培养基？我想楼主应该不会犯这么低级的错误吧。
2 抗生素浓度搞错？Amp的最大工作浓 ...

你说的这两点我应该没出问题，心想着过几天回家了一次搞定才做了这么多，还是不能太急于求成啊会是dna不纯导致的连接失败么，帮我看下我传的那两张电泳图。。感激
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YNWA!
9楼2012-07-17 15:26:45
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feitianrenwo

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
晕啊，你，原来是T载体连接，还用得着蓝白班筛选？
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10楼2012-07-17 15:28:34
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