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coral8813

新虫 (初入文坛)

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10楼: Originally posted by feitianrenwo at 2012-07-17 15:28:34
晕啊,你,原来是T载体连接,还用得着蓝白班筛选?

啊?什么意思。。我又无知了么。。我师姐以前用的也是这个啊,当时没什么问题的
YNWA!
11楼2012-07-17 15:32:03
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zqx128

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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9楼: Originally posted by coral8813 at 2012-07-17 15:26:45
你说的这两点我应该没出问题,心想着过几天回家了一次搞定才做了这么多,还是不能太急于求成啊会是dna不纯导致的连接失败么,帮我看下我传的那两张电泳图。。感激...

你用的是什么Taq酶呀?末尾有加A吗?也或者你纯化回收的时候漂洗液没甩干净、乙醇没挥发净会影响连接反应的。我很多时候回收完了都不检测的,也照样连的很好啊。

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12楼2012-07-17 15:46:37
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coral8813

新虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by zqx128 at 2012-07-17 15:46:37
你用的是什么Taq酶呀?末尾有加A吗?也或者你纯化回收的时候漂洗液没甩干净、乙醇没挥发净会影响连接反应的。我很多时候回收完了都不检测的,也照样连的很好啊。...

pcr用的一直是promega的Go Tag 无色的mix,末尾肯定会加A的吧。。要真是不纯的原因你说我能不能回收了之后再回收啊,那样DNA会不会有损失什么的啊
YNWA!
13楼2012-07-17 16:01:30
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zqx128

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-18 13:50:55
引用回帖:
13楼: Originally posted by coral8813 at 2012-07-17 16:01:30
pcr用的一直是promega的Go Tag 无色的mix,末尾肯定会加A的吧。。要真是不纯的原因你说我能不能回收了之后再回收啊,那样DNA会不会有损失什么的啊...

可以的,损失肯定有的,但是连接用的DNA量很少的,你可以把洗脱体积用到建议的最小量。两遍漂洗之后,一定要空离心一次,然后把柱子在空气中放置一会,闻不到酒精的味道了就可以加洗脱液了。残留的酒精对后续反应影响很大。祝好!
14楼2012-07-17 16:23:36
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zqx128

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助,积极解答问题 2012-07-18 13:51:12
引用回帖:
11楼: Originally posted by coral8813 at 2012-07-17 15:32:03
啊?什么意思。。我又无知了么。。我师姐以前用的也是这个啊,当时没什么问题的...

DNA片段成功插入至T Vector中后,一般情况下 β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏,重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时,基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合,克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称,2 kbp的DNA片段插入到载体中后,重组克隆体仍显示了蓝色。所以,当我们没有得到白色菌落时,可以试着检测蓝色菌落。
也有转化后的菌落全为蓝色,但有目的DNA片段的插入的情况,因为
插入的DNA片段较短(小于500 bp),且插入片段没有影响LacZ基因的读框,此时平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色(或淡蓝色)。
鉴于以上原因,加上我们反正也是要进行菌落PCR来进行阳性克隆筛选的,所以现在很多人就不加X-Gal、IPTG了。
15楼2012-07-18 11:39:08
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万丽丽081222

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主,你现在知道怎么回事了吗?我的蓝白斑筛选的板子上也什么都没有长,求教!!!!!!
learnenglish
16楼2013-12-25 11:30:28
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