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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蓝白斑筛选什么都没长，不是感受态的问题。真诚求助高手解答！
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coral8813

新虫 (初入文坛)

[求助] 蓝白斑筛选什么都没长，不是感受态的问题。真诚求助高手解答！ 已有1人参与

我昨天中午涂板做的蓝白斑筛选实验，今天早上一看什么都没长，培养了接近20个小时了。我做的阴性对照，在amp、IPTG、X-gal平板涂感受态什么都没长；阳性对照不加amp的LB平板涂上感受态，菌长成一片，而且感受态是我自己新做的，4度放置12-24小时使用的应该不会有问题。会是连接液的问题么？用的promega的PGEM-T载体，不过在冰箱放了有一年半载的了，但是应该问题不大吧。到底是怎么回事啊！上周做也是什么都没长，当时没做对照我以为是感受态的问题所以重新做的，用的氯化钙法。真不知道为什么失败，求助啊求助！
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YNWA!
1楼 2012-07-17 09:27:02
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coral8813

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by feitianrenwo at 2012-07-17 11:00:44
建议你这样做：
1、转个PUC19：amp、 x-gal 、IPTG的板子
   验证你的感受太细胞是否有问题
2、空载体转化
   验证你的载体是否有问题

如果都没有问题就可以继续做下一步了


如果上面两个实验都不行，建 ...

首先十分感谢~~现在这个载体用完了，我在想会不会是我的DNA不纯呢，我是做的DGGE割胶之后用索莱宝的聚丙烯酰胺凝胶电泳回收试剂盒回收的，pcr琼脂糖跑出来的电泳没有杂带，下图1；为了进一步纯化我又将其割胶再次用琼脂糖回收试剂盒回收，但是pcr电泳之后就有严重的拖尾了，下图2；所以我直接用的DGGE直接回收的DNA pcr之后连接的，会是这个问题么。。为什么回收之后反倒拖尾这么严重了，真是弄不清啊。。

dgge回收



琼脂糖回收
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YNWA!
7楼2012-07-17 15:20:23
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
我的板子开始什么都没长是因为没调pH（话说国产试剂一定要调pH啊），
后来有段时间长了，再做就又没有了，刚换了新的感受态，还不晓得结果。希望楼主赶快找到原因。
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2楼2012-07-17 10:34:23
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coral8813

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ZOEY21 at 2012-07-17 10:34:23
我的板子开始什么都没长是因为没调pH（话说国产试剂一定要调pH啊），
后来有段时间长了，再做就又没有了，刚换了新的感受态，还不晓得结果。希望楼主赶快找到原因。

谢谢回答~我也用的国产试剂，配LB确实加了不少氢氧化钠才把ph调到7.2 应该不是这里的问题，所以我还是怀疑我的连接出问题了，具体步骤都是按说明书上来的，不知怎么搞得。你也注意下除了感受态是不是其他问题。。我下次一定少做点，这一次做了三十多过都没长太郁闷了。。
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YNWA!
3楼2012-07-17 10:43:52
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feitianrenwo

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
amisking: 金币+5, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-17 21:03:54
amisking: 回帖置顶 2012-07-17 21:03:56
建议你这样做：
1、转个PUC19：amp、 x-gal 、IPTG的板子
   验证你的感受太细胞是否有问题
2、空载体转化
   验证你的载体是否有问题

如果都没有问题就可以继续做下一步了


如果上面两个实验都不行，建议你买国外进口的amp 、 x-gal 、IPTG
其中x-gal 用DMF配，x-gal 和IPTG均要用锡箔纸包好避光，-20℃保存


希望能帮到你
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4楼2012-07-17 11:00:44
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