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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)

[求助] 蓝白斑筛选没有菌落,或者都是白斑,是什么情况已有1人参与

如题,我用TAKARA的DH5a, PMD18做克隆,按照试剂盒说明进行,载体与插入DNA分子按照3:1进行连接,16度三十分钟(也做过四个小时),以空载质粒作对照,37度培养14-16个小时,没有出现东西(20个小时候看到平板边缘出现小透明菌斑,中央好像菌落连在一片),但是空载质粒对照没有篮斑出现,请问这是什么原因?

[ Last edited by ljx2ljx on 2013-6-2 at 21:52 ]
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-06-03 18:27:46
你做的是TA克隆?空的T载体不自连是好事吧。20小时培养时间太长了,可能是板上的氨苄失效了。没有蓝斑有可能是筛选药品的问题,你应该用一个pUC18之类的质粒做对照。
2楼2013-06-03 01:35:33
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-03 01:35:33
你做的是TA克隆?空的T载体不自连是好事吧。20小时培养时间太长了,可能是板上的氨苄失效了。没有蓝斑有可能是筛选药品的问题,你应该用一个pUC18之类的质粒做对照。

我做的是TA克隆,用的是PUC19质粒做对照,但是没有看到篮斑。甚至有些时候干脆都没有长菌落。
3楼2013-06-03 08:57:55
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流! 2013-06-03 18:27:56
我前一段时间也在做蓝白斑筛选,一开始做的时候平板上长得也全是白斑,没有蓝斑,但是酶切鉴定时没有目的条带,最近情况有所好转,个人觉得应该是你转化的问题,在者就是你的连接体系中目的片段与载体的量的问题,
4楼2013-06-03 09:53:45
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 20083630zhan at 2013-06-03 09:53:45
我前一段时间也在做蓝白斑筛选,一开始做的时候平板上长得也全是白斑,没有蓝斑,但是酶切鉴定时没有目的条带,最近情况有所好转,个人觉得应该是你转化的问题,在者就是你的连接体系中目的片段与载体的量的问题,

昨天又做了一次,以空载质粒作对照也没有长出菌落,那应该是感受态出毛病了吧
5楼2013-06-03 10:01:06
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by ljx2ljx at 2013-06-03 08:57:55
我做的是TA克隆,用的是PUC19质粒做对照,但是没有看到篮斑。甚至有些时候干脆都没有长菌落。...

pUC19质粒应该长很多菌落,而且是蓝斑。如果你的质粒对照不长菌,说明感受态不行或者中间操作有严重失误。
6楼2013-06-04 01:31:43
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王者归来001

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
一般空质粒的蓝斑需要时间稍长一些才会出现,按照合适的比例连接一般都会连上,所以基本上都是白斑。
坚持不懈,终会成功!
7楼2013-06-04 23:09:24
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zhouking8758

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
不长菌估计是感受态不行,或者氨苄浓度过高。感受态不好的可能性最大。
如果长的菌落正常,但是都是白斑,可能就是IPTG或者x-gal有问题。
8楼2013-06-04 23:22:20
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zhouking8758 at 2013-06-04 23:22:20
不长菌估计是感受态不行,或者氨苄浓度过高。感受态不好的可能性最大。
如果长的菌落正常,但是都是白斑,可能就是IPTG或者x-gal有问题。

已经找到原因,氨苄失效了,多谢各位
9楼2013-06-07 08:52:08
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DoctorWatson

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by ljx2ljx at 2013-06-07 08:52:08
已经找到原因,氨苄失效了,多谢各位...

不可能是AM失效。如果失效则全是蓝斑。不会长不出来。
10楼2014-09-17 16:04:12
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