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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蓝白斑筛选没有菌落，或者都是白斑，是什么情况
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)

[求助] 蓝白斑筛选没有菌落，或者都是白斑，是什么情况 已有1人参与

如题，我用TAKARA的DH5a, PMD18做克隆，按照试剂盒说明进行，载体与插入DNA分子按照3：1进行连接，16度三十分钟（也做过四个小时），以空载质粒作对照，37度培养14-16个小时，没有出现东西（20个小时候看到平板边缘出现小透明菌斑，中央好像菌落连在一片），但是空载质粒对照没有篮斑出现，请问这是什么原因？

[ Last edited by ljx2ljx on 2013-6-2 at 21:52 ]
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1楼 2013-06-02 21:51:30
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-03 18:27:46
你做的是TA克隆？空的T载体不自连是好事吧。20小时培养时间太长了，可能是板上的氨苄失效了。没有蓝斑有可能是筛选药品的问题，你应该用一个pUC18之类的质粒做对照。
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2楼2013-06-03 01:35:33
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-03 01:35:33
你做的是TA克隆？空的T载体不自连是好事吧。20小时培养时间太长了，可能是板上的氨苄失效了。没有蓝斑有可能是筛选药品的问题，你应该用一个pUC18之类的质粒做对照。

我做的是TA克隆，用的是PUC19质粒做对照，但是没有看到篮斑。甚至有些时候干脆都没有长菌落。
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3楼2013-06-03 08:57:55
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-06-03 18:27:56
我前一段时间也在做蓝白斑筛选，一开始做的时候平板上长得也全是白斑，没有蓝斑，但是酶切鉴定时没有目的条带，最近情况有所好转，个人觉得应该是你转化的问题，在者就是你的连接体系中目的片段与载体的量的问题，
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4楼2013-06-03 09:53:45
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 20083630zhan at 2013-06-03 09:53:45
我前一段时间也在做蓝白斑筛选，一开始做的时候平板上长得也全是白斑，没有蓝斑，但是酶切鉴定时没有目的条带，最近情况有所好转，个人觉得应该是你转化的问题，在者就是你的连接体系中目的片段与载体的量的问题，

昨天又做了一次，以空载质粒作对照也没有长出菌落，那应该是感受态出毛病了吧
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5楼2013-06-03 10:01:06
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by ljx2ljx at 2013-06-03 08:57:55
我做的是TA克隆，用的是PUC19质粒做对照，但是没有看到篮斑。甚至有些时候干脆都没有长菌落。...

pUC19质粒应该长很多菌落，而且是蓝斑。如果你的质粒对照不长菌，说明感受态不行或者中间操作有严重失误。
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6楼2013-06-04 01:31:43
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王者归来001

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般空质粒的蓝斑需要时间稍长一些才会出现，按照合适的比例连接一般都会连上，所以基本上都是白斑。
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坚持不懈,终会成功!
7楼2013-06-04 23:09:24
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zhouking8758

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不长菌估计是感受态不行，或者氨苄浓度过高。感受态不好的可能性最大。
如果长的菌落正常，但是都是白斑，可能就是IPTG或者x-gal有问题。
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8楼2013-06-04 23:22:20
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhouking8758 at 2013-06-04 23:22:20
不长菌估计是感受态不行，或者氨苄浓度过高。感受态不好的可能性最大。
如果长的菌落正常，但是都是白斑，可能就是IPTG或者x-gal有问题。

已经找到原因，氨苄失效了，多谢各位
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9楼2013-06-07 08:52:08
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DoctorWatson

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by ljx2ljx at 2013-06-07 08:52:08
已经找到原因，氨苄失效了，多谢各位...

不可能是AM失效。如果失效则全是蓝斑。不会长不出来。
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10楼2014-09-17 16:04:12
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