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人于两点

铜虫 (小有名气)

[求助] 质粒和片段连接后,酶切验证错误!(求大神指导)已有2人参与

如图所示,line 1和2 是质粒和片段(图片不清晰,用红线代替)连接后的酶切验证
质粒大小为4570bp 片段大小为750bp
因为把连接好的质粒送过去测序,发现正向引物F(片段的)测序无信号,反向引物R(片段的)测序是正确的。
所以,想酶切验证一下,发现酶切下来的片段大小不对,酶切的片段大小约为1000,而目的片段为750bp。
哪位大神告诉我是什么原因啊?

质粒和片段连接后,酶切验证错误!(求大神指导)
图片1.png
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s_lich28

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-19 18:18:13
楼主的目标片段大小是750bp,但图中lane 2中楼主用红线标注出来的片段如果是实际接入的片段的话那长度是1kb,所以建议楼主验证目标片段后再做链接。
There is nothing either good or bad, thinking makes it so.
2楼2014-10-18 21:47:41
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人于两点

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by s_lich28 at 2014-10-18 21:47:41
楼主的目标片段大小是750bp,但图中lane 2中楼主用红线标注出来的片段如果是实际接入的片段的话那长度是1kb,所以建议楼主验证目标片段后再做链接。

额,那为什么我测序结果是对的?
3楼2014-10-19 13:54:21
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s_lich28

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 人于两点 at 2014-10-19 14:54:21
额,那为什么我测序结果是对的?...

楼主测序的正向引物是从质粒上开始还是从目标片段上开始读的?
There is nothing either good or bad, thinking makes it so.
4楼2014-10-19 14:58:44
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人于两点

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by s_lich28 at 2014-10-19 14:58:44
楼主测序的正向引物是从质粒上开始还是从目标片段上开始读的?...

正反引物都是质粒的通用引物(都是在质粒酶切位点上)
5楼2014-10-19 16:55:00
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s_lich28

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 人于两点 at 2014-10-19 17:55:00
正反引物都是质粒的通用引物(都是在质粒酶切位点上)...

我觉得楼主的正向引物测序结果无信号和接进去片段的大小有出入是不同的问题。测序无信号通常是小提的样品不纯或者是PCR后的纯化没做好引起的。而酶切以后发现目的片段大小不对可能是接入的时候片段长度就有问题,所以还是建议楼主重新确认接入前的片段长度。希望楼主实验顺利。
There is nothing either good or bad, thinking makes it so.
6楼2014-10-19 21:37:25
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人于两点

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by s_lich28 at 2014-10-19 21:37:25
我觉得楼主的正向引物测序结果无信号和接进去片段的大小有出入是不同的问题。测序无信号通常是小提的样品不纯或者是PCR后的纯化没做好引起的。而酶切以后发现目的片段大小不对可能是接入的时候片段长度就有问题,所 ...

第一,我是觉得如果插入的是错误的片段,R引物就不可能测序是正确的,但是结果是正确的,所以想问原因。至于F引物测序无信号,可能就是引物放的时间久了,我没有纠结啊!
第二,酶切前的片段,酶切后连接前的片段酶切产物,都跑胶看了,大小都是在700bp左右的。
第三,我已经重新做了,只是想了解原因,避免再次出现这种情况。
7楼2014-10-20 10:30:19
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guoliwang

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

既然反向引物测序结果没问题,那至少一个酶切位点没问题。楼主弄明白可以再合成两个测序引物,把反向引物测明的序列两侧的序列也测出来,看看另外一个酶切位点位置到底在哪里,以及两侧是否有突变增加了酶切位点。
慎思明辨博学笃行
8楼2014-11-18 18:57:41
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