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人于两点

铜虫 (小有名气)

[求助] 质粒和片段连接后,酶切验证错误!(求大神指导)已有2人参与

如图所示,line 1和2 是质粒和片段(图片不清晰,用红线代替)连接后的酶切验证
质粒大小为4570bp 片段大小为750bp
因为把连接好的质粒送过去测序,发现正向引物F(片段的)测序无信号,反向引物R(片段的)测序是正确的。
所以,想酶切验证一下,发现酶切下来的片段大小不对,酶切的片段大小约为1000,而目的片段为750bp。
哪位大神告诉我是什么原因啊?

质粒和片段连接后,酶切验证错误!(求大神指导)
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guoliwang

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

既然反向引物测序结果没问题,那至少一个酶切位点没问题。楼主弄明白可以再合成两个测序引物,把反向引物测明的序列两侧的序列也测出来,看看另外一个酶切位点位置到底在哪里,以及两侧是否有突变增加了酶切位点。
慎思明辨博学笃行
8楼2014-11-18 18:57:41
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s_lich28

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-19 18:18:13
楼主的目标片段大小是750bp,但图中lane 2中楼主用红线标注出来的片段如果是实际接入的片段的话那长度是1kb,所以建议楼主验证目标片段后再做链接。
There is nothing either good or bad, thinking makes it so.
2楼2014-10-18 21:47:41
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人于两点

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by s_lich28 at 2014-10-18 21:47:41
楼主的目标片段大小是750bp,但图中lane 2中楼主用红线标注出来的片段如果是实际接入的片段的话那长度是1kb,所以建议楼主验证目标片段后再做链接。

额,那为什么我测序结果是对的?
3楼2014-10-19 13:54:21
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s_lich28

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 人于两点 at 2014-10-19 14:54:21
额,那为什么我测序结果是对的?...

楼主测序的正向引物是从质粒上开始还是从目标片段上开始读的?
There is nothing either good or bad, thinking makes it so.
4楼2014-10-19 14:58:44
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