| 查看: 2231 | 回复: 7 | |||
梦涵angle铁虫 (初入文坛)
|
[求助]
求去掉环状质粒中酶切位点和切后的质粒连接问题？
|
| 我想切掉质粒上salI 与HindIII之间的一个酶切位点，选这两种酶作为酶切点，切完后具体如何使用T4聚合酶或者Klenow Fragment使末端平滑化？如何再使切好的质粒再连成环状？ 第一次发帖，有点激动，可能说的不是很明白，求解！谢谢各位啊！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 核酸生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有170人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 连接转化假阳性提不出来质粒吗？
已经有8人回复
- 双酶切之后，线状质粒的连接问题
已经有13人回复
- 空质粒双酶切后大小不对，纠结！
已经有11人回复
- 质粒酶切之后电泳呈弥散状是什么原因
已经有16人回复
- 我构建质粒后酶切验证的问题
已经有13人回复
- 质粒酶切切不动，质粒在宿主中繁衍酶切位点会突变么？
已经有8人回复
- 环形质粒酶切电泳图分析求解
已经有25人回复
- 有谁知道关于Pfrt I 质粒的信息，包括他的基因序列和含有的酶切位点。急啊
已经有4人回复
- 做酶切连接后转化再提质粒，质粒明显变小，Why???
已经有24人回复
- 质粒单酶切之后比原始质粒变小了！！！？？
已经有7人回复
- 将质粒上紧挨着的两个酶切位点进行双酶切后连接外源基因片段，是不是不好连接？
已经有13人回复
- 质粒DNA用EcoR1和HindⅢ双酶切后电泳图，求鉴
已经有6人回复
- 【求助/交流】质粒DNA可以不通过酶切直接跑电泳检测吗？
已经有24人回复
- 【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办
已经有17人回复
- 【求助/交流】关于红色荧光质粒（RFP）的一些问题
已经有4人回复
- 【求助/交流】质粒单酶切后竟然两条带
已经有32人回复
- 【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？
已经有20人回复
- 【求助/交流】双酶切质粒后，目的条带浅且前方有模糊亮带
已经有12人回复
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
-
专家经验: +24 - MolEPI: 31
- 应助: 599 (博士)
- 贵宾: 2.689
- 金币: 24334.9
- 散金: 1088
- 红花: 88
- 沙发: 2
- 帖子: 2327
- 在线: 623.1小时
- 虫号: 849017
- 注册: 2009-09-16
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
- 管辖: 分子生物
2楼2013-11-08 19:28:48
梦涵angle
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 3083
- 散金: 60
- 帖子: 43
- 在线: 40.1小时
- 虫号: 1095183
- 注册: 2010-09-10
- 性别: MM
- 专业: 细胞呼吸与代谢
3楼2013-11-08 19:42:48
4楼2013-11-08 20:05:56
yb19841014
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 45 (小学生)
- 金币: 21099
- 散金: 5
- 红花: 2
- 帖子: 2549
- 在线: 155.6小时
- 虫号: 2256089
- 注册: 2013-01-23
- 专业: 河口海岸学
5楼2013-11-08 21:51:47
yelangfh713
至尊木虫 (正式写手)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 9681.1
- 散金: 100
- 红花: 1
- 帖子: 863
- 在线: 150.3小时
- 虫号: 479236
- 注册: 2007-12-14
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-08 23:12:53
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-08 23:12:53
| 应该还要看你用哪个公司的酶来选择失活温度吧。一般TOYOBO的HindIII需要在90度5分钟才能使酶的残余活性为0.还有双切的时候如果不是用诸如Fermentas公司的fast digest buffer的话，对于HindIII，我的经验是最好酶切时间更长一点，我之前做都是20h。我的步骤是：20h双酶切完毕后酶失活5分钟，跑电泳切胶回收质粒（这样可以把salI和HindIII中间切下来的小片段去除），你把它再连成环状需要用到T4连接酶，不过你没有提到目的基因，一般目的基因应该是一段两端带salI和HindIII酶切序列的PCR扩增片段（即insert），计算好insert和vector的mol比大概在3:1，体系总DNA量最好在10-100ng，整个体系总量20μl，不足的用水补足，在室温下（23-26度）连接1个小时左右，再用乙醇沉淀法去除杂质得到你需要的plasmid，不知道能不能帮到你。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
梦涵angle6楼2013-11-08 22:25:03
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
-
专家经验: +24 - MolEPI: 31
- 应助: 599 (博士)
- 贵宾: 2.689
- 金币: 24334.9
- 散金: 1088
- 红花: 88
- 沙发: 2
- 帖子: 2327
- 在线: 623.1小时
- 虫号: 849017
- 注册: 2009-09-16
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
- 管辖: 分子生物
7楼2013-11-08 23:19:57
梦涵angle
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 3083
- 散金: 60
- 帖子: 43
- 在线: 40.1小时
- 虫号: 1095183
- 注册: 2010-09-10
- 性别: MM
- 专业: 细胞呼吸与代谢
8楼2013-11-09 09:21:58
