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梦涵angle铁虫 (初入文坛)
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求去掉环状质粒中酶切位点和切后的质粒连接问题？
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| 我想切掉质粒上salI 与HindIII之间的一个酶切位点，选这两种酶作为酶切点，切完后具体如何使用T4聚合酶或者Klenow Fragment使末端平滑化？如何再使切好的质粒再连成环状？ 第一次发帖，有点激动，可能说的不是很明白，求解！谢谢各位啊！ |
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 核酸生物学实验经验 |
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| 应该还要看你用哪个公司的酶来选择失活温度吧。一般TOYOBO的HindIII需要在90度5分钟才能使酶的残余活性为0.还有双切的时候如果不是用诸如Fermentas公司的fast digest buffer的话，对于HindIII，我的经验是最好酶切时间更长一点，我之前做都是20h。我的步骤是：20h双酶切完毕后酶失活5分钟，跑电泳切胶回收质粒（这样可以把salI和HindIII中间切下来的小片段去除），你把它再连成环状需要用到T4连接酶，不过你没有提到目的基因，一般目的基因应该是一段两端带salI和HindIII酶切序列的PCR扩增片段（即insert），计算好insert和vector的mol比大概在3:1，体系总DNA量最好在10-100ng，整个体系总量20μl，不足的用水补足，在室温下（23-26度）连接1个小时左右，再用乙醇沉淀法去除杂质得到你需要的plasmid，不知道能不能帮到你。 |
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梦涵angle6楼2013-11-08 22:25:03
gyesang
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