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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求去掉环状质粒中酶切位点和切后的质粒连接问题？
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梦涵angle

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求去掉环状质粒中酶切位点和切后的质粒连接问题？

我想切掉质粒上salI 与HindIII之间的一个酶切位点，选这两种酶作为酶切点，切完后具体如何使用T4聚合酶或者Klenow Fragment使末端平滑化？如何再使切好的质粒再连成环状？ 第一次发帖，有点激动，可能说的不是很明白，求解！谢谢各位啊！
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1楼2013-11-08 18:55:18
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yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)
我觉得2楼的方法 最后得到的质粒 3个酶切位点都被破坏了啊
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5楼2013-11-08 21:51:47
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梦涵angle: 金币+10, ★★★很有帮助, 非常感谢 2013-11-08 19:41:19
将你的质粒用SalI和HindIII这两个酶进行双酶切2-4小时，然后65度热失活下这两个酶，往体系里面加1ul 2mM 的dNTP和T4 DNA polymerase，室温30min，胶回收再T4连接酶连接，转化
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2楼2013-11-08 19:28:48
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梦涵angle

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-08 19:28:48
将你的质粒用SalI和HindIII这两个酶进行双酶切2-4小时，然后65度热失活下这两个酶，往体系里面加1ul 2mM 的dNTP和T4 DNA polymerase，室温30min，胶回收再T4连接酶连接，转化

请问一下，双切2-4h能切开吗
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3楼2013-11-08 19:42:48
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yaping1988

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 梦涵angle at 2013-11-08 19:42:48
请问一下，双切2-4h能切开吗...

你就切4h保险一些吧
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4楼2013-11-08 20:05:56
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