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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求去掉环状质粒中酶切位点和切后的质粒连接问题？
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梦涵angle

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求去掉环状质粒中酶切位点和切后的质粒连接问题？

我想切掉质粒上salI 与HindIII之间的一个酶切位点，选这两种酶作为酶切点，切完后具体如何使用T4聚合酶或者Klenow Fragment使末端平滑化？如何再使切好的质粒再连成环状？ 第一次发帖，有点激动，可能说的不是很明白，求解！谢谢各位啊！
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1楼 2013-11-08 18:55:18
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梦涵angle

铁虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by yelangfh713 at 2013-11-08 22:25:03
应该还要看你用哪个公司的酶来选择失活温度吧。一般TOYOBO的HindIII需要在90度5分钟才能使酶的残余活性为0.还有双切的时候如果不是用诸如Fermentas公司的fast digest buffer的话，对于HindIII，我的经验是最好酶切时 ...

谢谢！我的目的基因连在另外的地方！
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8楼2013-11-09 09:21:58
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梦涵angle: 金币+10, ★★★很有帮助, 非常感谢 2013-11-08 19:41:19
将你的质粒用SalI和HindIII这两个酶进行双酶切2-4小时，然后65度热失活下这两个酶，往体系里面加1ul 2mM 的dNTP和T4 DNA polymerase，室温30min，胶回收再T4连接酶连接，转化
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2楼2013-11-08 19:28:48
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梦涵angle

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-08 19:28:48
将你的质粒用SalI和HindIII这两个酶进行双酶切2-4小时，然后65度热失活下这两个酶，往体系里面加1ul 2mM 的dNTP和T4 DNA polymerase，室温30min，胶回收再T4连接酶连接，转化

请问一下，双切2-4h能切开吗
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3楼2013-11-08 19:42:48
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yaping1988

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 梦涵angle at 2013-11-08 19:42:48
请问一下，双切2-4h能切开吗...

你就切4h保险一些吧
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4楼2013-11-08 20:05:56
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