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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » PBI121载体与目的片段连接后双酶切问题
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960550050

铁虫 (小有名气)

[求助] PBI121载体与目的片段连接后双酶切问题 已有1人参与

我将PBI121载体与我的克隆载体同时用Xba1和Sac1双酶切后胶回收，连接，转化的到肠杆菌，涂板，有菌落长出，挑单菌落，菌液PCR验证，正确，提质粒后PCR验证也正确，可是再进行双酶切验证时总是切不开，酶切产物有条带，只是就一个条带，请问大家这是怎么回事啊？！急！！
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1楼 2014-10-07 16:19:49
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

microgen

铁虫 (初入文坛)
表示楼主这种情况会不会是你的PCR体系里有组分抑制酶切作用额
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12楼2014-10-08 22:08:49
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wuruonan

新虫 (初入文坛)
楼主pbi121载体用这两个酶酶切的体系是什么？最近一直切不开
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22楼2016-03-19 16:40:24
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普通回帖

gaohuihui

铁杆木虫 (著名写手)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 屏蔽内容, 重复 2014-10-07 18:25:46
本帖内容被屏蔽
2楼2014-10-07 16:25:33
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gaohuihui

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
960550050: 金币+5 2014-10-07 16:47:17
只有一条带，是单酶切大小的条带么？如果是的话，你用两个酶分别单切，看一下是哪个酶切位点有问题再说
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3楼2014-10-07 16:26:28
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960550050

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaohuihui at 2014-10-07 16:25:33
只有一条带，是单酶切大小的条带么？如果是的话，你用两个酶分别单切，看一下是哪个酶有问题再说

怎么看是不是但酶切大小的条带呢，如果是没有切开不是也有一条带吗，条带大小大于15000bp
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4楼2014-10-07 16:39:52
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gaohuihui

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 960550050 at 2014-10-07 16:39:52
怎么看是不是但酶切大小的条带呢，如果是没有切开不是也有一条带吗，条带大小大于15000bp...

一般用环形marker检测质粒大小，线性marker检测酶切片段的大小，质粒切没切开点两个marker就能看出来了。
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5楼2014-10-07 18:09:49
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gaohuihui

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 960550050 at 2014-10-07 16:39:52
怎么看是不是但酶切大小的条带呢，如果是没有切开不是也有一条带吗，条带大小大于15000bp...

如果没有环形marker，你上样时就多点几微升，若是没切开的质粒应该有三条带的，只是上面两条带稍微淡一点
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

960550050
6楼2014-10-07 18:12:20
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960550050

铁虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by gaohuihui at 2014-10-07 18:12:20
如果没有环形marker，你上样时就多点几微升，若是没切开的质粒应该有三条带的，只是上面两条带稍微淡一点...

哦，谢谢啊，我今天把质粒跟酶切产物一起跑电泳，结果在一条线上，那是不是能说明没有切开啊，谢谢啊
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7楼2014-10-07 19:19:53
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gaohuihui

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 960550050 at 2014-10-07 19:19:53
哦，谢谢啊，我今天把质粒跟酶切产物一起跑电泳，结果在一条线上，那是不是能说明没有切开啊，谢谢啊...

嗯  是
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8楼2014-10-07 19:24:51
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960550050

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gaohuihui at 2014-10-07 19:24:51
嗯  是...

我做了好几次酶切都没切开，您分析应该是什么情况啊，我的体系是Xba1 1μl  Sac1 1μl  10*M Buffer 2μl 质粒16μl
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9楼2014-10-08 08:12:52
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960550050

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gaohuihui at 2014-10-07 19:24:51
嗯  是...

前面的菌液PCR和质粒PCR都能出来是不是说明已经连接上了啊
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10楼2014-10-08 08:14:21
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