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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » PBI121载体与目的片段连接后双酶切问题
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gaohuihui

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 960550050 at 2014-10-08 08:14:21
前面的菌液PCR和质粒PCR都能出来是不是说明已经连接上了啊...

菌液PCR验证正确，质粒大小也正确就是连上了，你这个酶切体系中质粒浓度有点高了啊，不好切开。我一般用5ul的酶切验证体系，1ul质粒就够了，还省时间。
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960550050
11楼2014-10-08 10:34:41
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microgen

铁虫 (初入文坛)
表示楼主这种情况会不会是你的PCR体系里有组分抑制酶切作用额
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12楼2014-10-08 22:08:49
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960550050

铁虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by gaohuihui at 2014-10-08 10:34:41
菌液PCR验证正确，质粒大小也正确就是连上了，你这个酶切体系中质粒浓度有点高了啊，不好切开。我一般用5ul的酶切验证体系，1ul质粒就够了，还省时间。...

哦哦，谢谢啊！我再重新切一下试试吧

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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13楼2014-10-09 23:09:15
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960550050

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by microgen at 2014-10-08 22:08:49
表示楼主这种情况会不会是你的PCR体系里有组分抑制酶切作用额

这个是直接用质粒酶切的，没有PCR啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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14楼2014-10-09 23:10:59
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qiqi_mother

新虫 (初入文坛)
楼主切开了吗？这两个酶的Buffer应该是不一样的吧？记忆中SacI是低盐Buffer：L，XbaI则是中盐buffer：M,  通常这种情况下要分别酶切，先低盐Buffer酶切再高盐Buffer酶切，否则SacI在高盐Buffer中不起作用的，个人经验，仅供参考！
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15楼2014-10-10 13:21:10
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960550050

铁虫 (小有名气)
没切开，但是之前的时候都是这样一起切的，能切开，就是pBI121与目的基因连上以后就切不开了
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16楼2014-10-11 16:33:04
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960550050

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by qiqi_mother at 2014-10-10 13:21:10
楼主切开了吗？这两个酶的Buffer应该是不一样的吧？记忆中SacI是低盐Buffer：L，XbaI则是中盐buffer：M,  通常这种情况下要分别酶切，先低盐Buffer酶切再高盐Buffer酶切，否则SacI在高盐Buffer中不起作用的，个人经 ...

没切开，但是之前的时候都是这样一起切的，能切开，就是pBI121与目的基因连上以后就切不开了
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17楼2014-10-11 16:34:01
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qiqi_mother

新虫 (初入文坛)
分别酶切也不行吗？先sac l,再xba l
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18楼2014-10-13 16:42:57
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960550050

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by qiqi_mother at 2014-10-13 16:42:57
分别酶切也不行吗？先sac l,再xba l

非常感谢您的回复，我现在切开了，但是目的条带很弱，最上面跟质粒差不多大小的条带很亮，不知道是什么原因啊
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19楼2014-10-14 11:46:20
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qiqi_mother

新虫 (初入文坛)
有没有考虑甲基化的影响，XbaI会产生甲基化位点，使用的菌株是Dam和Dcm甲基化酶欠缺型菌株吗？如果切开了，那应该没问题了
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20楼2014-10-15 16:42:21
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