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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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gaohuihui

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 960550050 at 2014-10-08 08:14:21
前面的菌液PCR和质粒PCR都能出来是不是说明已经连接上了啊...

菌液PCR验证正确,质粒大小也正确就是连上了,你这个酶切体系中质粒浓度有点高了啊,不好切开。我一般用5ul的酶切验证体系,1ul质粒就够了,还省时间。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

11楼2014-10-08 10:34:41
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microgen

铁虫 (初入文坛)

表示楼主这种情况会不会是你的PCR体系里有组分抑制酶切作用额
12楼2014-10-08 22:08:49
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960550050

铁虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by gaohuihui at 2014-10-08 10:34:41
菌液PCR验证正确,质粒大小也正确就是连上了,你这个酶切体系中质粒浓度有点高了啊,不好切开。我一般用5ul的酶切验证体系,1ul质粒就够了,还省时间。...

哦哦,谢谢啊!我再重新切一下试试吧

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
13楼2014-10-09 23:09:15
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960550050

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by microgen at 2014-10-08 22:08:49
表示楼主这种情况会不会是你的PCR体系里有组分抑制酶切作用额

这个是直接用质粒酶切的,没有PCR啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
14楼2014-10-09 23:10:59
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qiqi_mother

新虫 (初入文坛)

楼主切开了吗?这两个酶的Buffer应该是不一样的吧?记忆中SacI是低盐Buffer:L,XbaI则是中盐buffer:M,  通常这种情况下要分别酶切,先低盐Buffer酶切再高盐Buffer酶切,否则SacI在高盐Buffer中不起作用的,个人经验,仅供参考!
15楼2014-10-10 13:21:10
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960550050

铁虫 (小有名气)

没切开,但是之前的时候都是这样一起切的,能切开,就是pBI121与目的基因连上以后就切不开了
16楼2014-10-11 16:33:04
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960550050

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by qiqi_mother at 2014-10-10 13:21:10
楼主切开了吗?这两个酶的Buffer应该是不一样的吧?记忆中SacI是低盐Buffer:L,XbaI则是中盐buffer:M,  通常这种情况下要分别酶切,先低盐Buffer酶切再高盐Buffer酶切,否则SacI在高盐Buffer中不起作用的,个人经 ...

没切开,但是之前的时候都是这样一起切的,能切开,就是pBI121与目的基因连上以后就切不开了
17楼2014-10-11 16:34:01
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qiqi_mother

新虫 (初入文坛)

分别酶切也不行吗?先sac l,再xba l
18楼2014-10-13 16:42:57
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960550050

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
18楼: Originally posted by qiqi_mother at 2014-10-13 16:42:57
分别酶切也不行吗?先sac l,再xba l

非常感谢您的回复,我现在切开了,但是目的条带很弱,最上面跟质粒差不多大小的条带很亮,不知道是什么原因啊
19楼2014-10-14 11:46:20
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qiqi_mother

新虫 (初入文坛)

有没有考虑甲基化的影响,XbaI会产生甲基化位点,使用的菌株是Dam和Dcm甲基化酶欠缺型菌株吗?如果切开了,那应该没问题了
20楼2014-10-15 16:42:21
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