应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PBI121载体酶切后回收
291/3返回列表123下一页
查看: 2744  |  回复: 28
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

王艳xinwei

银虫 (小有名气)

[求助] PBI121载体酶切后回收

各位虫友，最近小虾我在做表达载体的构建，要用到PBI121这个表达载体，进行双酶切后要对其胶回收，这两个酶切位点相距很近，中间就隔了BamH1，前段时间用OMEGA胶回收试剂盒做预实验没有回收到这么大片段的DNA，所以在这寻得帮助，怎样才能回收这么大片段的DNA,大小将近13kb。
       另一个问题是我用NEB家的酶，用Xba1和sma1进行双酶切，但是温度不统一，所以先进行了Sma1 25度单酶切，后没有电泳胶回收，而是直接将sma1 65度失活，再进行了xba1 37度酶切，同时加了BSA。这两个酶有通用的buffer，所以第二次的xba1酶切没再加buffer。NEB网站上介绍了这种分开酶切，不知道是因为上面介绍的原因，还是我自己理解问题，我就是没有弄明白中间是不是需要纯化再进行第二次的酶切，还是按我这用方式，希望得到大家的帮助
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
坚持就是胜利
1楼 2013-07-13 22:54:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wenzi6337

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
王艳xinwei: 金币+3, ★有帮助 2013-07-16 07:30:02
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-16 09:14:34
大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2013-07-15 19:53:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
王艳xinwei: 金币+2, ★有帮助 2013-07-14 09:07:10
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-16 09:14:14
对于大于10kb的片段，你可以试试大片段回收试剂盒。
酶作用温度不同完全可以按照你做的那样，用smaI切完后不用回收，失活后直接加xbaI做酶切。此外，如果只是把载体切成线状（两个酶切位点很近），你可以直接乙醇沉淀纯化回收片段，避免胶回收可能出现的问题。
赞一下 回复此楼
2楼2013-07-14 00:26:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王艳xinwei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-14 00:26:03
对于大于10kb的片段，你可以试试大片段回收试剂盒。
酶作用温度不同完全可以按照你做的那样，用smaI切完后不用回收，失活后直接加xbaI做酶切。此外，如果只是把载体切成线状（两个酶切位点很近），你可以直接乙醇沉 ...

谢谢，我还想问一下，后做xba1酶切的时候我就不用再一次加buffer了吧
赞一下 回复此楼
坚持就是胜利
3楼2013-07-14 09:06:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-16 09:14:23
引用回帖:
3楼: Originally posted by 王艳xinwei at 2013-07-14 09:06:15
谢谢，我还想问一下，后做xba1酶切的时候我就不用再一次加buffer了吧...

如果两个酶的buffer相同，不用再加buffer，还用原来的体系就可以了。
赞一下 回复此楼
4楼2013-07-14 11:39:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王艳xinwei

银虫 (小有名气)
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-16 09:15:02
内容已删除
回复此楼
坚持就是胜利
6楼2013-07-16 07:34:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 王艳xinwei at 2013-07-16 07:34:42
请问有没有NEB酶切3小时没有切开的现象，我昨天做了sma1酶切后，进行了xbaI酶切，竟然在打算回收的时候没有切下我的目的片段，我现在非常苦恼，怀疑自己构建的克隆载体都有问题了，但我测序结果没问题啊，请帮忙分 ...

首先你确定两支酶都是好用的，按照质粒的量使用酶。做分步酶切时，你用smaI切完后不要失活，先点2μl电泳检测是否完全切成线性分子。电泳确定smaI切完全后失活smaI, 再加xbaI切。最后回收全部样品前也先点一点样品电泳看酶切效果。做克隆不要怕麻烦，每一步验证正确后再往下做，应该没有问题的。
赞一下 回复此楼
7楼2013-07-16 11:31:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王艳xinwei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-16 11:31:13
首先你确定两支酶都是好用的，按照质粒的量使用酶。做分步酶切时，你用smaI切完后不要失活，先点2μl电泳检测是否完全切成线性分子。电泳确定smaI切完全后失活smaI, 再加xbaI切。最后回收全部样品前也先点一点样品 ...

谢谢，坚持不懈~
回复此楼
坚持就是胜利
8楼2013-07-16 12:16:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wenzi6337

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 王艳xinwei at 2013-07-16 07:34:42
请问有没有NEB酶切3小时没有切开的现象，我昨天做了sma1酶切后，进行了xbaI酶切，竟然在打算回收的时候没有切下我的目的片段，我现在非常苦恼，怀疑自己构建的克隆载体都有问题了，但我测序结果没问题啊，请帮忙分 ...

我用的是Takara限制酶，NEB的不清楚，不过按照你说的情况，这两个酶切位点很近，是不是应该考虑保护碱基，有时保护碱基不足，酶活性只有20y要延长酶切时间甚至可以过夜酶切,如果不存在保护碱基问题可以尝试换别的公司限制酶试试。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
9楼2013-07-16 13:34:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王艳xinwei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wenzi6337 at 2013-07-16 13:34:02
我用的是Takara限制酶，NEB的不清楚，不过按照你说的情况，这两个酶切位点很近，是不是应该考虑保护碱基，有时保护碱基不足，酶活性只有20y要延长酶切时间甚至可以过夜酶切,如果不存在保护碱基问题可以尝试换别的公 ...

我再试一下延长酶切时间~
赞一下 回复此楼
坚持就是胜利
10楼2013-07-16 20:39:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 王艳xinwei 的主题更新
291/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 复试调剂 +5 积极向上； 2026-04-10 7/350 2026-04-11 00:27 by only周
[考研] 一志愿西北工业大学289 085602 +31 yang婷 2026-04-10 31/1550 2026-04-11 00:19 by gong120082
[考研] 280求调剂 +12 李rien 2026-04-04 12/600 2026-04-10 21:19 by zhouxiaoyu
[考研] 293求调剂 +4 勇远库爱314 2026-04-06 4/200 2026-04-10 11:00 by 高维春
[考研] 301求调剂 +4 XYPLR 2026-04-05 6/300 2026-04-10 09:17 by Delta2012
[考研] 求调剂 +15 张zic 2026-04-05 16/800 2026-04-10 08:12 by kangsm
[考研] 086003调剂求助 +19 苏弋万 2026-04-09 20/1000 2026-04-09 20:48 by bljnqdcc
[考研] 296求调剂 +5 汪！？！ 2026-04-09 5/250 2026-04-09 17:47 by 柠檬不酸zy
[考研] 085400电子信息类（川大控制工程）求调剂可跨专业 求老师联系 +3 626776879 2026-04-08 3/150 2026-04-09 16:05 by 猪会飞
[考研] 化学工程与技术专业一志愿哈工程 291分B区 国家级大创负责人 有一作论文 +13 Emmy~ 2026-04-09 13/650 2026-04-09 14:47 by only周
[考研] 材料专硕322 +14 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-05 14/700 2026-04-09 13:25 by 5268321
[考研] 070300化学学硕311分求调剂 +18 梁富贵险中求 2026-04-04 20/1000 2026-04-09 11:18 by 哒哒哒呱呱呱
[考研] 353求调剂 +8 晴空万里air 2026-04-07 8/400 2026-04-09 00:18 by GouQ
[考研] 0703调剂，一志愿天津大学319分 +23 haaaabcd 2026-04-05 26/1300 2026-04-08 16:19 by luoyongfeng
[考研] 一志愿211，化学学硕，310分，本科重点双非，求调剂 +10 努力奋斗112 2026-04-07 10/500 2026-04-08 15:01 by screening
[考研] 323求调剂 +3 林zlu 2026-04-07 4/200 2026-04-07 23:21 by lbsjt
[考研] 化学357分，考研调剂 +11 .Starry. 2026-04-04 12/600 2026-04-06 06:28 by houyaoxu
[考研] 358求调剂 +7 秋gk 2026-04-04 7/350 2026-04-05 13:29 by huangmoli
[考研] 0854求调剂 +4 assdll 2026-04-04 4/200 2026-04-05 09:44 by zhq0425
[考研] 求调剂 +3 农业工程与信息� 2026-04-04 3/150 2026-04-04 12:19 by 舍而后得
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭