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tulip1213

银虫 (小有名气)

[求助] pB121SmaI酶切

最近做克隆,很纠结已经做了很长时间,选择单酶切,载体也去磷酸化了死活构不上,
无奈对载体进行改构,引入SmaI位点,测序也测过了。改构确实引入了SmaI位点。但是做过一次,仍然不灵。
想问各位:
碰到SmaI 切,怎么处理?
是先用SmaI30度切,酚氯仿去酶,再加另一酶,还是直接加入另外一酶。
今天对改构的pBI121酶切鉴定,请各位帮我判断一下,载体有没被SmaI或SacI切动?泳道依次是Marker,质粒,SmaI,SacI,SmaI+SacI(应放出750bp条带)
双酶切怎么看不出切出的条带?

问.jpg

[ Last edited by tulip1213 on 2012-11-11 at 00:11 ]
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
tulip1213: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-11-12 12:00:15
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-12 14:30:19
感觉你质粒提得不好,虽说是大质粒,浓度稀,有RNA污染,且只有开环和线性的带而没有超螺旋的带。上的是1kb ladder吧。从单酶切看应该是切开了。这么大的质粒切下来750bp很难从载体位置上看出来,而且大带总是比小带量很多的,你可以试试多上点双酶切的样品看是否有小带。不知道你用了多少量的质粒做的酶切。
2楼2012-11-11 02:30:47
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tulip1213

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-11 02:30:47
感觉你质粒提得不好,虽说是大质粒,浓度稀,有RNA污染,且只有开环和线性的带而没有超螺旋的带。上的是1kb ladder吧。从单酶切看应该是切开了。这么大的质粒切下来750bp很难从载体位置上看出来,而且大带总是比小带 ...

质粒生工试剂盒提的,上样的时候飘掉一些,我又重新做了单酶切,都切动了,原始质粒是三条带。只是疑惑为何双酶切就看不到切的条带。单酶切用了20uL质粒的量,双酶切用了40uL质粒的量。
3楼2012-11-11 10:32:37
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tulip1213

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-11 02:30:47
感觉你质粒提得不好,虽说是大质粒,浓度稀,有RNA污染,且只有开环和线性的带而没有超螺旋的带。上的是1kb ladder吧。从单酶切看应该是切开了。这么大的质粒切下来750bp很难从载体位置上看出来,而且大带总是比小带 ...

双酶切是60uL体系,全量上样
4楼2012-11-11 10:33:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
tulip1213: 金币+1, ★有帮助 2012-11-12 12:00:34
引用回帖:
3楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-11-11 10:32:37
质粒生工试剂盒提的,上样的时候飘掉一些,我又重新做了单酶切,都切动了,原始质粒是三条带。只是疑惑为何双酶切就看不到切的条带。单酶切用了20uL质粒的量,双酶切用了40uL质粒的量。...

你测了质粒的浓度没有?一般做双酶切用0.5ug质粒足够,考虑到你的质粒比较大,最好用2ug左右切。
5楼2012-11-12 02:15:34
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hchen82

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

6楼2012-11-28 10:53:37
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