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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pB121SmaI酶切
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tulip1213

银虫 (小有名气)

[求助] pB121SmaI酶切

最近做克隆，很纠结已经做了很长时间，选择单酶切，载体也去磷酸化了死活构不上，
无奈对载体进行改构，引入SmaI位点，测序也测过了。改构确实引入了SmaI位点。但是做过一次，仍然不灵。
想问各位：
碰到SmaI 切，怎么处理？
是先用SmaI30度切，酚氯仿去酶，再加另一酶，还是直接加入另外一酶。
今天对改构的pBI121酶切鉴定，请各位帮我判断一下，载体有没被SmaI或SacI切动？泳道依次是Marker,质粒，SmaI,SacI,SmaI+SacI(应放出750bp条带)
双酶切怎么看不出切出的条带？

问.jpg

[ Last edited by tulip1213 on 2012-11-11 at 00:11 ]
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1楼 2012-11-10 17:48:59
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tulip1213

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-11 02:30:47
感觉你质粒提得不好，虽说是大质粒，浓度稀，有RNA污染，且只有开环和线性的带而没有超螺旋的带。上的是1kb ladder吧。从单酶切看应该是切开了。这么大的质粒切下来750bp很难从载体位置上看出来，而且大带总是比小带 ...

双酶切是60uL体系，全量上样
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4楼2012-11-11 10:33:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tulip1213: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-11-12 12:00:15
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-12 14:30:19
感觉你质粒提得不好，虽说是大质粒，浓度稀，有RNA污染，且只有开环和线性的带而没有超螺旋的带。上的是1kb ladder吧。从单酶切看应该是切开了。这么大的质粒切下来750bp很难从载体位置上看出来，而且大带总是比小带量很多的，你可以试试多上点双酶切的样品看是否有小带。不知道你用了多少量的质粒做的酶切。
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2楼2012-11-11 02:30:47
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tulip1213

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-11 02:30:47
感觉你质粒提得不好，虽说是大质粒，浓度稀，有RNA污染，且只有开环和线性的带而没有超螺旋的带。上的是1kb ladder吧。从单酶切看应该是切开了。这么大的质粒切下来750bp很难从载体位置上看出来，而且大带总是比小带 ...

质粒生工试剂盒提的，上样的时候飘掉一些，我又重新做了单酶切，都切动了，原始质粒是三条带。只是疑惑为何双酶切就看不到切的条带。单酶切用了20uL质粒的量，双酶切用了40uL质粒的量。
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3楼2012-11-11 10:32:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
tulip1213: 金币+1, ★有帮助 2012-11-12 12:00:34
引用回帖:
3楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-11-11 10:32:37
质粒生工试剂盒提的，上样的时候飘掉一些，我又重新做了单酶切，都切动了，原始质粒是三条带。只是疑惑为何双酶切就看不到切的条带。单酶切用了20uL质粒的量，双酶切用了40uL质粒的量。...

你测了质粒的浓度没有？一般做双酶切用0.5ug质粒足够，考虑到你的质粒比较大，最好用2ug左右切。
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5楼2012-11-12 02:15:34
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