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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
17楼: Originally posted by wenzi6337 at 2013-07-17 14:01:39
首先,900bp的片段用Axygen(非托勿疑)回收效果很好,酶切问题可以分步酶切,检测到底是哪个酶(位点)没切开,再进行后续改进。...

Axygen是一个公司吧?我一般割胶回收后的量就很少了,也是用的试剂盒。酶切我继续试试,师姐说我的菌液有问题,但以前测序是对的,就是菌液放的时间有点长
Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
21楼2013-07-18 10:43:00
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
20楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-18 10:34:29
片段是用加酶切位点引物扩出来的,然后连到pMD-18T载体上,测过序结果是对的,就是菌液时间有点长,有半年了,但每次都是新摇的菌...

你说的菌液时间有点长是什么概念?切的不是质粒吗?提质粒不是挑单克隆摇菌做mini prep的吗?
如果序列正确,质粒大小也正确,可以分别用两个酶做单酶切,确定是不是哪个酶不好了。如果两个单酶切反应都完全正确地把质粒切成线状分子,双酶切应该没有问题的。
22楼2013-07-18 12:00:37
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
22楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-18 12:00:37
你说的菌液时间有点长是什么概念?切的不是质粒吗?提质粒不是挑单克隆摇菌做mini prep的吗?
如果序列正确,质粒大小也正确,可以分别用两个酶做单酶切,确定是不是哪个酶不好了。如果两个单酶切反应都完全正确地 ...

保存菌液,是去年做出来的,测序是对的,然后每次做的时候新摇菌,然后提质粒酶切,再请教一下:每次摇菌12个小时,然后3ml菌液提质粒,用30微升双蒸水洗脱,质粒浓度怎样?
Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
23楼2013-07-18 17:56:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
23楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-18 17:56:52
保存菌液,是去年做出来的,测序是对的,然后每次做的时候新摇菌,然后提质粒酶切,再请教一下:每次摇菌12个小时,然后3ml菌液提质粒,用30微升双蒸水洗脱,质粒浓度怎样?...

一般提质粒的菌摇14小时,你可以看下浊度。一般从3ml菌液用盒子提的质粒有10μg左右。按照你说的情况,浓度应该有几百ng/μl。
24楼2013-07-19 00:51:24
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
24楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-19 00:51:24
一般提质粒的菌摇14小时,你可以看下浊度。一般从3ml菌液用盒子提的质粒有10μg左右。按照你说的情况,浓度应该有几百ng/μl。...

那这个浓度10μl 的质粒做酶切,两个酶各加1μl ,4μl buffer,双蒸水配平至20μl 双酶切可以吗?
Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
25楼2013-07-19 09:21:24
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

这两个酶完全可以同时酶切哈,加BSA,在25 deg. 酶切过夜。建议采用50 uL体系,酶切过夜,然后直接胶回收,甚至直接加入600 uL的binding buffer后直接过胶回收柱就可以得到你的片段。good luck!
互助互励,共奋共进!!
26楼2013-07-19 10:37:50
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
25楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-19 09:21:24
那这个浓度10μl 的质粒做酶切,两个酶各加1μl ,4μl buffer,双蒸水配平至20μl 双酶切可以吗?...

一般酶切体系是1μg质粒DNA/20μl,最好不要超过1μg/10μl。
27楼2013-07-19 23:46:25
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 妥亮亮 at 2013-07-16 21:15:36
大片段回收用乙醇沉降,用玻璃奶回收试剂盒也不错,有共同buffer的双酶切,我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl),检测切开后,补加3μL buffer,把体系扩大到60μl,再加入另一种酶切。
...

检测切开是怎么检测呢,从酶切产物中取一部分PCR吗?
Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
28楼2013-07-22 00:21:50
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
27楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-19 23:46:25
一般酶切体系是1μg质粒DNA/20μl,最好不要超过1μg/10μl。...

好的,太谢谢了
Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
29楼2013-07-22 00:33:23
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