17楼: Originally posted by wenzi6337 at 2013-07-17 14:01:39
首先，900bp的片段用Axygen(非托勿疑)回收效果很好，酶切问题可以分步酶切，检测到底是哪个酶（位点）没切开，再进行后续改进。...

20楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-18 10:34:29
片段是用加酶切位点引物扩出来的，然后连到pMD-18T载体上，测过序结果是对的，就是菌液时间有点长，有半年了，但每次都是新摇的菌...

22楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-18 12:00:37
你说的菌液时间有点长是什么概念？切的不是质粒吗？提质粒不是挑单克隆摇菌做mini prep的吗？
如果序列正确，质粒大小也正确，可以分别用两个酶做单酶切，确定是不是哪个酶不好了。如果两个单酶切反应都完全正确地 ...

23楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-18 17:56:52
保存菌液，是去年做出来的，测序是对的，然后每次做的时候新摇菌，然后提质粒酶切，再请教一下：每次摇菌12个小时，然后3ml菌液提质粒，用30微升双蒸水洗脱，质粒浓度怎样？...

24楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-19 00:51:24
一般提质粒的菌摇14小时，你可以看下浊度。一般从3ml菌液用盒子提的质粒有10μg左右。按照你说的情况，浓度应该有几百ng/μl。...

25楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-19 09:21:24
那这个浓度10μl 的质粒做酶切，两个酶各加1μl ，4μl buffer，双蒸水配平至20μl 双酶切可以吗？...

12楼: Originally posted by 妥亮亮 at 2013-07-16 21:15:36
大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。
...

27楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-19 23:46:25
一般酶切体系是1μg质粒DNA/20μl，最好不要超过1μg/10μl。...