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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PBI121载体酶切后回收
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by wenzi6337 at 2013-07-17 14:01:39
首先，900bp的片段用Axygen(非托勿疑)回收效果很好，酶切问题可以分步酶切，检测到底是哪个酶（位点）没切开，再进行后续改进。...

Axygen是一个公司吧？我一般割胶回收后的量就很少了，也是用的试剂盒。酶切我继续试试，师姐说我的菌液有问题，但以前测序是对的，就是菌液放的时间有点长
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
21楼2013-07-18 10:43:00
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
20楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-18 10:34:29
片段是用加酶切位点引物扩出来的，然后连到pMD-18T载体上，测过序结果是对的，就是菌液时间有点长，有半年了，但每次都是新摇的菌...

你说的菌液时间有点长是什么概念？切的不是质粒吗？提质粒不是挑单克隆摇菌做mini prep的吗？
如果序列正确，质粒大小也正确，可以分别用两个酶做单酶切，确定是不是哪个酶不好了。如果两个单酶切反应都完全正确地把质粒切成线状分子，双酶切应该没有问题的。
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22楼2013-07-18 12:00:37
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
22楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-18 12:00:37
你说的菌液时间有点长是什么概念？切的不是质粒吗？提质粒不是挑单克隆摇菌做mini prep的吗？
如果序列正确，质粒大小也正确，可以分别用两个酶做单酶切，确定是不是哪个酶不好了。如果两个单酶切反应都完全正确地 ...

保存菌液，是去年做出来的，测序是对的，然后每次做的时候新摇菌，然后提质粒酶切，再请教一下：每次摇菌12个小时，然后3ml菌液提质粒，用30微升双蒸水洗脱，质粒浓度怎样？
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
23楼2013-07-18 17:56:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
23楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-18 17:56:52
保存菌液，是去年做出来的，测序是对的，然后每次做的时候新摇菌，然后提质粒酶切，再请教一下：每次摇菌12个小时，然后3ml菌液提质粒，用30微升双蒸水洗脱，质粒浓度怎样？...

一般提质粒的菌摇14小时，你可以看下浊度。一般从3ml菌液用盒子提的质粒有10μg左右。按照你说的情况，浓度应该有几百ng/μl。
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24楼2013-07-19 00:51:24
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
24楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-19 00:51:24
一般提质粒的菌摇14小时，你可以看下浊度。一般从3ml菌液用盒子提的质粒有10μg左右。按照你说的情况，浓度应该有几百ng/μl。...

那这个浓度10μl 的质粒做酶切，两个酶各加1μl ，4μl buffer，双蒸水配平至20μl 双酶切可以吗？
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
25楼2013-07-19 09:21:24
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

这两个酶完全可以同时酶切哈，加BSA，在25 deg. 酶切过夜。建议采用50 uL体系，酶切过夜，然后直接胶回收，甚至直接加入600 uL的binding buffer后直接过胶回收柱就可以得到你的片段。good luck！
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互助互励，共奋共进！！
26楼2013-07-19 10:37:50
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
25楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-19 09:21:24
那这个浓度10μl 的质粒做酶切，两个酶各加1μl ，4μl buffer，双蒸水配平至20μl 双酶切可以吗？...

一般酶切体系是1μg质粒DNA/20μl，最好不要超过1μg/10μl。
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27楼2013-07-19 23:46:25
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 妥亮亮 at 2013-07-16 21:15:36
大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。
...

检测切开是怎么检测呢，从酶切产物中取一部分PCR吗？
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
28楼2013-07-22 00:21:50
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
27楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-19 23:46:25
一般酶切体系是1μg质粒DNA/20μl，最好不要超过1μg/10μl。...

好的，太谢谢了
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29楼2013-07-22 00:33:23
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