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王艳xinwei银虫 (小有名气)
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PBI121载体酶切后回收
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各位虫友，最近小虾我在做表达载体的构建，要用到PBI121这个表达载体，进行双酶切后要对其胶回收，这两个酶切位点相距很近，中间就隔了BamH1，前段时间用OMEGA胶回收试剂盒做预实验没有回收到这么大片段的DNA，所以在这寻得帮助，怎样才能回收这么大片段的DNA,大小将近13kb。 另一个问题是我用NEB家的酶，用Xba1和sma1进行双酶切，但是温度不统一，所以先进行了Sma1 25度单酶切，后没有电泳胶回收，而是直接将sma1 65度失活，再进行了xba1 37度酶切，同时加了BSA。这两个酶有通用的buffer，所以第二次的xba1酶切没再加buffer。NEB网站上介绍了这种分开酶切，不知道是因为上面介绍的原因，还是我自己理解问题，我就是没有弄明白中间是不是需要纯化再进行第二次的酶切，还是按我这用方式，希望得到大家的帮助 |
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wenzi6337
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)回收效果很好，酶切问题可以分步酶切，检测到底是哪个酶（位点）没切开，再进行后续改进。
17楼2013-07-17 14:01:39
cicelyzh
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