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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PBI121载体酶切后回收
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)

[求助] PBI121载体酶切后回收

各位虫友，最近小虾我在做表达载体的构建，要用到PBI121这个表达载体，进行双酶切后要对其胶回收，这两个酶切位点相距很近，中间就隔了BamH1，前段时间用OMEGA胶回收试剂盒做预实验没有回收到这么大片段的DNA，所以在这寻得帮助，怎样才能回收这么大片段的DNA,大小将近13kb。
       另一个问题是我用NEB家的酶，用Xba1和sma1进行双酶切，但是温度不统一，所以先进行了Sma1 25度单酶切，后没有电泳胶回收，而是直接将sma1 65度失活，再进行了xba1 37度酶切，同时加了BSA。这两个酶有通用的buffer，所以第二次的xba1酶切没再加buffer。NEB网站上介绍了这种分开酶切，不知道是因为上面介绍的原因，还是我自己理解问题，我就是没有弄明白中间是不是需要纯化再进行第二次的酶切，还是按我这用方式，希望得到大家的帮助
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坚持就是胜利
1楼2013-07-13 22:54:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wenzi6337

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
王艳xinwei: 金币+3, ★有帮助 2013-07-16 07:30:02
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-16 09:14:34
大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。
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5楼2013-07-15 19:53:25
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
王艳xinwei: 金币+2, ★有帮助 2013-07-14 09:07:10
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-16 09:14:14
对于大于10kb的片段，你可以试试大片段回收试剂盒。
酶作用温度不同完全可以按照你做的那样，用smaI切完后不用回收，失活后直接加xbaI做酶切。此外，如果只是把载体切成线状（两个酶切位点很近），你可以直接乙醇沉淀纯化回收片段，避免胶回收可能出现的问题。
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2楼2013-07-14 00:26:03
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-14 00:26:03
对于大于10kb的片段，你可以试试大片段回收试剂盒。
酶作用温度不同完全可以按照你做的那样，用smaI切完后不用回收，失活后直接加xbaI做酶切。此外，如果只是把载体切成线状（两个酶切位点很近），你可以直接乙醇沉 ...

谢谢，我还想问一下，后做xba1酶切的时候我就不用再一次加buffer了吧
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坚持就是胜利
3楼2013-07-14 09:06:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-16 09:14:23
引用回帖:
3楼: Originally posted by 王艳xinwei at 2013-07-14 09:06:15
谢谢，我还想问一下，后做xba1酶切的时候我就不用再一次加buffer了吧...

如果两个酶的buffer相同，不用再加buffer，还用原来的体系就可以了。
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4楼2013-07-14 11:39:36
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-16 09:15:02
内容已删除
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坚持就是胜利
6楼2013-07-16 07:34:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 王艳xinwei at 2013-07-16 07:34:42
请问有没有NEB酶切3小时没有切开的现象，我昨天做了sma1酶切后，进行了xbaI酶切，竟然在打算回收的时候没有切下我的目的片段，我现在非常苦恼，怀疑自己构建的克隆载体都有问题了，但我测序结果没问题啊，请帮忙分 ...

首先你确定两支酶都是好用的，按照质粒的量使用酶。做分步酶切时，你用smaI切完后不要失活，先点2μl电泳检测是否完全切成线性分子。电泳确定smaI切完全后失活smaI, 再加xbaI切。最后回收全部样品前也先点一点样品电泳看酶切效果。做克隆不要怕麻烦，每一步验证正确后再往下做，应该没有问题的。
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7楼2013-07-16 11:31:13
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-16 11:31:13
首先你确定两支酶都是好用的，按照质粒的量使用酶。做分步酶切时，你用smaI切完后不要失活，先点2μl电泳检测是否完全切成线性分子。电泳确定smaI切完全后失活smaI, 再加xbaI切。最后回收全部样品前也先点一点样品 ...

谢谢，坚持不懈~
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坚持就是胜利
8楼2013-07-16 12:16:22
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wenzi6337

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 王艳xinwei at 2013-07-16 07:34:42
请问有没有NEB酶切3小时没有切开的现象，我昨天做了sma1酶切后，进行了xbaI酶切，竟然在打算回收的时候没有切下我的目的片段，我现在非常苦恼，怀疑自己构建的克隆载体都有问题了，但我测序结果没问题啊，请帮忙分 ...

我用的是Takara限制酶，NEB的不清楚，不过按照你说的情况，这两个酶切位点很近，是不是应该考虑保护碱基，有时保护碱基不足，酶活性只有20y要延长酶切时间甚至可以过夜酶切,如果不存在保护碱基问题可以尝试换别的公司限制酶试试。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2013-07-16 13:34:02
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wenzi6337 at 2013-07-16 13:34:02
我用的是Takara限制酶，NEB的不清楚，不过按照你说的情况，这两个酶切位点很近，是不是应该考虑保护碱基，有时保护碱基不足，酶活性只有20y要延长酶切时间甚至可以过夜酶切,如果不存在保护碱基问题可以尝试换别的公 ...

我再试一下延长酶切时间~
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坚持就是胜利
10楼2013-07-16 20:39:49
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