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dfm1987

新虫 (初入文坛)

[求助] PBI121载体转化拟南芥,Tail-PCR扩增整合位点侧翼序列,为何只扩增得到载体部分序列? 已有1人参与

我用热不对称方法扩增PBI121载体转化拟南芥得到的转化子的T-DNA整合位点侧翼序列;上游简并引物和下游特异性序列(RB区域)都是别人文献当中用过的,但是第三轮引物扩增的结果1000bp左右,经测序结果验证依然是PBI121的序列(RB区域上游)。我一直以为PBI121的整合特点是从RB和LB区域断开,整合到植物基因组中,但是我扩增出的结果又好像不是。求解,请各位大侠帮帮忙!还有一般大家是用哪种方法扩增T-DNA整合位点侧翼序列的?
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-10 18:36:12
建议LZ先找到断裂位点,再设计特异嵌套式引物进行tail-PCR,这样更加靠谱!
2楼2012-04-08 20:50:57
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dfm1987

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 太极拳 at 2012-04-08 20:50:57:
建议LZ先找到断裂位点,再设计特异嵌套式引物进行tail-PCR,这样更加靠谱!

一般文献的说法是从RB和LB区域断裂,所以就在此区域设计了引物,结果扩出来的结果不是预期的,所以不知道是哪里出了问题。想了解一下有没有人遇到过这种情况。
5楼2012-04-10 00:11:25
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普通回帖

chengdongmey

金虫 (小有名气)

All is well.

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主转化的时候没有线性化质粒吗?
Alliswell.
3楼2012-04-08 22:16:41
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dfm1987

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by chengdongmey at 2012-04-08 22:16:41:
楼主转化的时候没有线性化质粒吗?

采用的农杆菌介导转化拟南芥,就是构了PBI121的重组质粒,然后转化农杆菌,用农杆菌侵染拟南芥,好像没有看到说要有线性化质粒的步骤。
4楼2012-04-10 00:05:45
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

一般是一般,但是你现在得到得结果不是一般,所以要重新确定,一段段设计引物扩增。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

6楼2012-04-10 09:48:41
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dfm1987

新虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by 太极拳 at 2012-04-10 09:48:41:
一般是一般,但是你现在得到得结果不是一般,所以要重新确定,一段段设计引物扩增。

谢谢你的建议
7楼2012-04-10 17:06:34
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lzh860801

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-10 18:36:29
lz你的情况和我很相似啊
我是设计的LB的引物 然后调到了载体内部去了
序列比对的时候发现NCBI上面PBI121这个载体有几个修改过的 它们的LB RB是反的 所以我目前把引物反过来设计准备重新调了

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

8楼2012-04-10 17:10:04
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dfm1987

新虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by lzh860801 at 2012-04-10 17:10:04:
lz你的情况和我很相似啊
我是设计的LB的引物 然后调到了载体内部去了
序列比对的时候发现NCBI上面PBI121这个载体有几个修改过的 它们的LB RB是反的 所以我目前把引物反过来设计准备重新调了

谢谢!但是我扩增的方向好像没有错,是往RB区域以外扩增的,但是得到1000bp左右的RB上游载体序列,没有得到植株基因组的序列
9楼2012-04-14 10:20:27
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caidan1385

新虫 (初入文坛)

我也遇到同样的问题,tail-pcr第三轮扩增得到的片段只有1000多,还是载体上的,不知道是怎么回事,都快被折腾死了,我现在就想知道RB和LB到底距离边界多远,我用的质粒是 pPK2  其原始质粒是 pPZP201希望好心人帮忙解
10楼2013-04-01 22:40:14
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