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WSW_Alone

木虫 (著名写手)

[求助] 高氏一号分离的菌用16S通用引物扩增不出条带

如题,最近用高氏一号涂布并分离保存菌种,肉眼观察应该都是细菌,进行鉴定的时候(模板直接是扎菌/菌液)用16S通用引物8f,1492r进行直接PCR,但是基本上扩增不出条带,即使扩增出来条带也很淡。
请教一下各位前辈这是什么情况?不胜感激。

PCR产物电泳结果
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處世樹為模,本固任從枝葉動;立身錢作樣,內方還要外邊圓。
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feierorange

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
WSW_Alone: 金币+1, 有帮助 2012-05-04 01:13:34
我们实验室做的都可以啊,应该和培养基关系不大吧,是不是PCR过程的问题呢?ps:我们用的引物是27f, 1492r或1525r了
2楼2012-03-22 09:27:33
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WSW_Alone

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by feierorange at 2012-03-22 09:27:33:
我们实验室做的都可以啊,应该和培养基关系不大吧,是不是PCR过程的问题呢?ps:我们用的引物是27f, 1492r或1525r了

你们预处理是怎样的?ps:引物关系很大吗?
處世樹為模,本固任從枝葉動;立身錢作樣,內方還要外邊圓。
3楼2012-03-22 09:29:38
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feierorange

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by WSW_Alone at 2012-03-22 09:29:38:
你们预处理是怎样的?ps:引物关系很大吗?

预处理很简单,就是菌体洗涤一下,也用的菌液,8f我没用过,不太清楚,PCR出问题的原因会比较多了,你是别的培养基都可以,唯独高氏一号不行吗?
4楼2012-03-22 09:39:40
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WSW_Alone

木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by feierorange at 2012-03-22 09:39:40:
预处理很简单,就是菌体洗涤一下,也用的菌液,8f我没用过,不太清楚,PCR出问题的原因会比较多了,你是别的培养基都可以,唯独高氏一号不行吗?

别的出来了大部分,高氏一号的90%都出不来。
處世樹為模,本固任從枝葉動;立身錢作樣,內方還要外邊圓。
5楼2012-03-22 09:48:59
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girlfisher

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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WSW_Alone: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-05-04 01:13:21
WSW_Alone: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-04 01:13:49
高氏一号分离放线菌,放线菌为G+,high G+C菌。一般直接菌体PCR细胞不易破碎,建议提取DNA再做PCR
6楼2012-03-22 11:45:05
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WSW_Alone

木虫 (著名写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by girlfisher at 2012-03-22 11:45:05:
高氏一号分离放线菌,放线菌为G+,high G+C菌。一般直接菌体PCR细胞不易破碎,建议提取DNA再做PCR

你们一般采用什么方法提取DNA?
處世樹為模,本固任從枝葉動;立身錢作樣,內方還要外邊圓。
7楼2012-03-23 09:27:40
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xiaoyong1982

禁虫 (小有名气)

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
WSW_Alone: 金币+2, 有帮助 2012-05-04 01:13:06
本帖内容被屏蔽

8楼2012-03-23 11:01:45
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WSW_Alone

木虫 (著名写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by xiaoyong1982 at 2012-03-23 11:01:45:
我也做过直接挑菌和提DNA做PCR,还是提DNA以后效果好很多,所以一般都是提DNA后再PCR,用普通的试剂盒做起来还是比较快的,有些菌在PCR体系里裂解不是很好

你说的这个情况可能是高氏一号培养基里的成分对PCR有 ...

是这样的,我高氏一号里面的菌是液体培养之后,用菌液作为模板进行扩增的。
處世樹為模,本固任從枝葉動;立身錢作樣,內方還要外邊圓。
9楼2012-03-24 17:56:47
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jocelyn2012

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
WSW_Alone: 金币+2, 有帮助 2012-05-04 01:12:55
应该是丝状菌的因素,以下是我在论坛上见到的最简单的方法,lz可以试下(我也没试过)
牙签挑取少量菌体(不用任何溶液)至PCR管,微波炉高火2至3min,加入PCR MIXTURE,混匀,加酶反应即可
注:菌体不要太多,一点点就够了,微波炉加热后再用枪头多吸打几次,让DNA充分溶出, 你做下试试,祝好运
(非原创,但一时找不到那帖子在哪,先用了)
10楼2012-05-03 14:44:40
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