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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 高氏一号分离的菌用16S通用引物扩增不出条带
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WSW_Alone

木虫 (著名写手)

[求助] 高氏一号分离的菌用16S通用引物扩增不出条带

如题，最近用高氏一号涂布并分离保存菌种，肉眼观察应该都是细菌，进行鉴定的时候（模板直接是扎菌/菌液）用16S通用引物8f,1492r进行直接PCR，但是基本上扩增不出条带，即使扩增出来条带也很淡。
请教一下各位前辈这是什么情况？不胜感激。

PCR产物电泳结果
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處世樹為模，本固任從枝葉動；立身錢作樣，內方還要外邊圓。
1楼 2012-03-22 00:39:22
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feierorange

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
WSW_Alone: 金币+1, ★有帮助 2012-05-04 01:13:34
我们实验室做的都可以啊，应该和培养基关系不大吧，是不是PCR过程的问题呢？ps:我们用的引物是27f, 1492r或1525r了
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2楼2012-03-22 09:27:33
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WSW_Alone

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by feierorange at 2012-03-22 09:27:33:
我们实验室做的都可以啊，应该和培养基关系不大吧，是不是PCR过程的问题呢？ps:我们用的引物是27f, 1492r或1525r了

你们预处理是怎样的？ps：引物关系很大吗？
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處世樹為模，本固任從枝葉動；立身錢作樣，內方還要外邊圓。
3楼2012-03-22 09:29:38
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feierorange

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by WSW_Alone at 2012-03-22 09:29:38:
你们预处理是怎样的？ps：引物关系很大吗？

预处理很简单，就是菌体洗涤一下，也用的菌液，8f我没用过，不太清楚，PCR出问题的原因会比较多了，你是别的培养基都可以，唯独高氏一号不行吗？
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4楼2012-03-22 09:39:40
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WSW_Alone

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by feierorange at 2012-03-22 09:39:40:
预处理很简单，就是菌体洗涤一下，也用的菌液，8f我没用过，不太清楚，PCR出问题的原因会比较多了，你是别的培养基都可以，唯独高氏一号不行吗？

别的出来了大部分，高氏一号的90%都出不来。
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處世樹為模，本固任從枝葉動；立身錢作樣，內方還要外邊圓。
5楼2012-03-22 09:48:59
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girlfisher

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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WSW_Alone: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-05-04 01:13:21
WSW_Alone: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-04 01:13:49
高氏一号分离放线菌，放线菌为G+，high G+C菌。一般直接菌体PCR细胞不易破碎，建议提取DNA再做PCR
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6楼2012-03-22 11:45:05
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WSW_Alone

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by girlfisher at 2012-03-22 11:45:05:
高氏一号分离放线菌，放线菌为G+，high G+C菌。一般直接菌体PCR细胞不易破碎，建议提取DNA再做PCR

你们一般采用什么方法提取DNA？
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處世樹為模，本固任從枝葉動；立身錢作樣，內方還要外邊圓。
7楼2012-03-23 09:27:40
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xiaoyong1982

禁虫 (小有名气)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
WSW_Alone: 金币+2, ★有帮助 2012-05-04 01:13:06
本帖内容被屏蔽
8楼2012-03-23 11:01:45
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WSW_Alone

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xiaoyong1982 at 2012-03-23 11:01:45:
我也做过直接挑菌和提DNA做PCR，还是提DNA以后效果好很多，所以一般都是提DNA后再PCR，用普通的试剂盒做起来还是比较快的，有些菌在PCR体系里裂解不是很好

你说的这个情况可能是高氏一号培养基里的成分对PCR有 ...

是这样的，我高氏一号里面的菌是液体培养之后，用菌液作为模板进行扩增的。
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處世樹為模，本固任從枝葉動；立身錢作樣，內方還要外邊圓。
9楼2012-03-24 17:56:47
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jocelyn2012

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
WSW_Alone: 金币+2, ★有帮助 2012-05-04 01:12:55
应该是丝状菌的因素，以下是我在论坛上见到的最简单的方法，lz可以试下（我也没试过）
牙签挑取少量菌体（不用任何溶液）至PCR管,微波炉高火2至3min,加入PCR MIXTURE,混匀,加酶反应即可
注：菌体不要太多,一点点就够了,微波炉加热后再用枪头多吸打几次,让DNA充分溶出, 你做下试试,祝好运
（非原创，但一时找不到那帖子在哪，先用了）
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10楼2012-05-03 14:44:40
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