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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PBI121载体酶切后回收
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妥亮亮

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:42:54
大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。

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总会有人成功，为什么不能是我呢？
11楼2013-07-16 21:15:15
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妥亮亮

金虫 (正式写手)
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:01
大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。

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总会有人成功，为什么不能是我呢？
12楼2013-07-16 21:15:36
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妥亮亮

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:07
对于大于10kb的片段，你可以试试大片段回收试剂盒。
酶作用温度不同完全可以按照你做的那样，用smaI切完后不用回收，失活后直接加xbaI做酶切。此外，如果只是把载体切成线状（两个酶切位点很近），你可以直接乙醇沉淀纯化回收片段，避免胶回收可能出现的问题。

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总会有人成功，为什么不能是我呢？
13楼2013-07-16 21:28:46
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:14
引用回帖:
5楼: Originally posted by wenzi6337 at 2013-07-15 19:53:25
大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。

900的片段可不可以用乙醇回收呢？我双酶切质粒，Ecorl和Xhol酶切位点，有共用buffer，温度也一样，为啥每次切完后都是两条在5000以上的条带？
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
14楼2013-07-17 10:18:48
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:21
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-16 11:31:13
首先你确定两支酶都是好用的，按照质粒的量使用酶。做分步酶切时，你用smaI切完后不要失活，先点2μl电泳检测是否完全切成线性分子。电泳确定smaI切完全后失活smaI, 再加xbaI切。最后回收全部样品前也先点一点样品 ...

Ecorl和Xhol双酶切切不开，每次都是两条5000以上的条带，目的片段是900的，什么情况啊
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
15楼2013-07-17 10:25:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:28
引用回帖:
15楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-17 10:25:52
Ecorl和Xhol双酶切切不开，每次都是两条5000以上的条带，目的片段是900的，什么情况啊...

确定质粒上带XhoI位点吗？
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16楼2013-07-17 12:45:41
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wenzi6337

木虫 (著名写手)
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:35
引用回帖:
14楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-17 10:18:48
900的片段可不可以用乙醇回收呢？我双酶切质粒，Ecorl和Xhol酶切位点，有共用buffer，温度也一样，为啥每次切完后都是两条在5000以上的条带？...

首先，900bp的片段用Axygen(非托勿疑)回收效果很好，酶切问题可以分步酶切，检测到底是哪个酶（位点）没切开，再进行后续改进。
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17楼2013-07-17 14:01:39
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夏尔list

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:42
PBI121很常用，正常的方法就行，没必要什么大片段。我们实验室就是这样的。用的TAKARA的酶。和普通的载体构建一样的
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18楼2013-07-17 23:16:19
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夏尔list

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:50
最好用同一个体系酶切吧，反正不建议分步酶切，我没用过这样的方法。我一般就用TAKARA的酶，TAKARA的酶一般都有公用缓冲液的，一个体系就行。
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19楼2013-07-17 23:19:39
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:56
引用回帖:
16楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-17 12:45:41
确定质粒上带XhoI位点吗？...

片段是用加酶切位点引物扩出来的，然后连到pMD-18T载体上，测过序结果是对的，就是菌液时间有点长，有半年了，但每次都是新摇的菌
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
20楼2013-07-18 10:34:29
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