应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PBI121载体酶切后回收
292/3返回列表上一页123下一页
查看: 3233  |  回复: 28
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

妥亮亮

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:42:54
大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
总会有人成功，为什么不能是我呢？
11楼2013-07-16 21:15:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

妥亮亮

金虫 (正式写手)
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:01
大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
总会有人成功，为什么不能是我呢？
12楼2013-07-16 21:15:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

妥亮亮

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:07
对于大于10kb的片段，你可以试试大片段回收试剂盒。
酶作用温度不同完全可以按照你做的那样，用smaI切完后不用回收，失活后直接加xbaI做酶切。此外，如果只是把载体切成线状（两个酶切位点很近），你可以直接乙醇沉淀纯化回收片段，避免胶回收可能出现的问题。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
总会有人成功，为什么不能是我呢？
13楼2013-07-16 21:28:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:14
引用回帖:
5楼: Originally posted by wenzi6337 at 2013-07-15 19:53:25
大片段回收用乙醇沉降，用玻璃奶回收试剂盒也不错，有共同buffer的双酶切，我一般是分别用SmaI和XbaI酶切(30μl)，检测切开后，补加3μL buffer，把体系扩大到60μl，再加入另一种酶切。

900的片段可不可以用乙醇回收呢？我双酶切质粒，Ecorl和Xhol酶切位点，有共用buffer，温度也一样，为啥每次切完后都是两条在5000以上的条带？
赞一下 回复此楼
Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
14楼2013-07-17 10:18:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:21
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-16 11:31:13
首先你确定两支酶都是好用的，按照质粒的量使用酶。做分步酶切时，你用smaI切完后不要失活，先点2μl电泳检测是否完全切成线性分子。电泳确定smaI切完全后失活smaI, 再加xbaI切。最后回收全部样品前也先点一点样品 ...

Ecorl和Xhol双酶切切不开，每次都是两条5000以上的条带，目的片段是900的，什么情况啊
赞一下 回复此楼
Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
15楼2013-07-17 10:25:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:28
引用回帖:
15楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-17 10:25:52
Ecorl和Xhol双酶切切不开，每次都是两条5000以上的条带，目的片段是900的，什么情况啊...

确定质粒上带XhoI位点吗？
赞一下 回复此楼
16楼2013-07-17 12:45:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wenzi6337

木虫 (著名写手)
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:35
引用回帖:
14楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-17 10:18:48
900的片段可不可以用乙醇回收呢？我双酶切质粒，Ecorl和Xhol酶切位点，有共用buffer，温度也一样，为啥每次切完后都是两条在5000以上的条带？...

首先，900bp的片段用Axygen(非托勿疑)回收效果很好，酶切问题可以分步酶切，检测到底是哪个酶（位点）没切开，再进行后续改进。
赞一下 回复此楼
17楼2013-07-17 14:01:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

夏尔list

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:42
PBI121很常用，正常的方法就行，没必要什么大片段。我们实验室就是这样的。用的TAKARA的酶。和普通的载体构建一样的
赞一下 回复此楼
18楼2013-07-17 23:16:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

夏尔list

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:50
最好用同一个体系酶切吧，反正不建议分步酶切，我没用过这样的方法。我一般就用TAKARA的酶，TAKARA的酶一般都有公用缓冲液的，一个体系就行。
赞一下 回复此楼
19楼2013-07-17 23:19:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-18 18:43:56
引用回帖:
16楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-17 12:45:41
确定质粒上带XhoI位点吗？...

片段是用加酶切位点引物扩出来的，然后连到pMD-18T载体上，测过序结果是对的，就是菌液时间有点长，有半年了，但每次都是新摇的菌
赞一下 回复此楼
Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
20楼2013-07-18 10:34:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 王艳xinwei 的主题更新
292/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 3/150 2026-11-10 16:32 by G2rhSvqvhNzl
[考博] 申请环境，微生物方向博士 +3 浅笑09 2026-11-08 3/150 2026-11-10 12:44 by 可淡不可忘
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 4/200 2026-11-10 12:30 by C6CRn66RYYXS
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 4/200 2026-11-10 12:19 by C6CRn66RYYXS
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 4/200 2026-11-10 11:35 by YHiw1gou1Eda
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 3/150 2026-11-10 01:40 by FChKX8meu1ds
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 4/200 2026-11-10 01:29 by FChKX8meu1ds
[考博] 27博士申请 +3 白白白ly 2026-11-09 3/150 2026-11-09 21:39 by szq0819
[文学芳草园] 厉娜 +3 张丹枫1991 2026-11-09 5/250 2026-11-09 16:53 by 张丹枫1991
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 12/600 2026-11-09 13:26 by Equinoxhua
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +6 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 14/700 2026-11-09 11:52 by GwrQVVR6Oenx
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 16/800 2026-11-09 11:47 by GwrQVVR6Oenx
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 12/600 2026-11-09 06:32 by l48hFd8Nwae2
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-09 00:14 by l48hFd8Nwae2
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:12 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 14/700 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 kvewwGtKktqB 2026-11-04 16/800 2026-11-06 05:00 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 02:04 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 hNpp4Y2CGvSC 2026-11-04 12/600 2026-11-06 01:53 by qL1cU46YIdK0
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭