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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PBI121载体酶切后回收
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)

[求助] PBI121载体酶切后回收

各位虫友，最近小虾我在做表达载体的构建，要用到PBI121这个表达载体，进行双酶切后要对其胶回收，这两个酶切位点相距很近，中间就隔了BamH1，前段时间用OMEGA胶回收试剂盒做预实验没有回收到这么大片段的DNA，所以在这寻得帮助，怎样才能回收这么大片段的DNA,大小将近13kb。
       另一个问题是我用NEB家的酶，用Xba1和sma1进行双酶切，但是温度不统一，所以先进行了Sma1 25度单酶切，后没有电泳胶回收，而是直接将sma1 65度失活，再进行了xba1 37度酶切，同时加了BSA。这两个酶有通用的buffer，所以第二次的xba1酶切没再加buffer。NEB网站上介绍了这种分开酶切，不知道是因为上面介绍的原因，还是我自己理解问题，我就是没有弄明白中间是不是需要纯化再进行第二次的酶切，还是按我这用方式，希望得到大家的帮助
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坚持就是胜利
1楼 2013-07-13 22:54:22
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
27楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-19 23:46:25
一般酶切体系是1μg质粒DNA/20μl，最好不要超过1μg/10μl。...

好的，太谢谢了
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
29楼2013-07-22 00:33:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
王艳xinwei: 金币+2, ★有帮助 2013-07-14 09:07:10
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-16 09:14:14
对于大于10kb的片段，你可以试试大片段回收试剂盒。
酶作用温度不同完全可以按照你做的那样，用smaI切完后不用回收，失活后直接加xbaI做酶切。此外，如果只是把载体切成线状（两个酶切位点很近），你可以直接乙醇沉淀纯化回收片段，避免胶回收可能出现的问题。
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2楼2013-07-14 00:26:03
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-14 00:26:03
对于大于10kb的片段，你可以试试大片段回收试剂盒。
酶作用温度不同完全可以按照你做的那样，用smaI切完后不用回收，失活后直接加xbaI做酶切。此外，如果只是把载体切成线状（两个酶切位点很近），你可以直接乙醇沉 ...

谢谢，我还想问一下，后做xba1酶切的时候我就不用再一次加buffer了吧
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坚持就是胜利
3楼2013-07-14 09:06:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-16 09:14:23
引用回帖:
3楼: Originally posted by 王艳xinwei at 2013-07-14 09:06:15
谢谢，我还想问一下，后做xba1酶切的时候我就不用再一次加buffer了吧...

如果两个酶的buffer相同，不用再加buffer，还用原来的体系就可以了。
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4楼2013-07-14 11:39:36
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