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人于两点

铜虫 (小有名气)

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[求助] 质粒和片段连接后，酶切验证错误！（求大神指导）已有2人参与

如图所示，line 1和2 是质粒和片段（图片不清晰，用红线代替）连接后的酶切验证
质粒大小为4570bp 片段大小为750bp
因为把连接好的质粒送过去测序，发现正向引物F（片段的）测序无信号，反向引物R（片段的）测序是正确的。
所以，想酶切验证一下，发现酶切下来的片段大小不对，酶切的片段大小约为1000，而目的片段为750bp。
哪位大神告诉我是什么原因啊？

图片1.png

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1楼2014-10-18 12:58:01

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引用回帖:

6楼: Originally posted by s_lich28 at 2014-10-19 21:37:25
我觉得楼主的正向引物测序结果无信号和接进去片段的大小有出入是不同的问题。测序无信号通常是小提的样品不纯或者是PCR后的纯化没做好引起的。而酶切以后发现目的片段大小不对可能是接入的时候片段长度就有问题，所 ...

第一，我是觉得如果插入的是错误的片段，R引物就不可能测序是正确的，但是结果是正确的，所以想问原因。至于F引物测序无信号，可能就是引物放的时间久了，我没有纠结啊！
第二，酶切前的片段，酶切后连接前的片段酶切产物，都跑胶看了，大小都是在700bp左右的。
第三，我已经重新做了，只是想了解原因，避免再次出现这种情况。