应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切酶连转化后单克隆检测不对
汕头大学海洋科学接受调剂
51/1返回列表
查看: 1834  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

fxj1986

木虫 (正式写手)

[交流] 酶切酶连转化后单克隆检测不对

自己构建的载体，片段7K左右；片段（3k）通过PCR扩增；电泳后回收进行酶切，酶切条件37℃，3h；再电泳后回收，酶连时载体：片段=1:1.5左右，转化DH5α，16h（氯霉素抗性）平板上单克隆很多；挑取单克隆进行菌落PCR验证（引物为自己设计），电泳结果显示除了目的条带外还有其他条带；对单克隆培养重新提取质粒进行双酶切后，只检测出一条带（与质粒大小基本一致），没有片段的目的条带。几次转化都如此，求分析，求经验！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-10-12 15:52:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶连时载体：片段=1:1.5？？？？我们一般是载体：片段的摩尔数=1:3~1:10.
赞一下 回复此楼
9楼2014-03-03 17:12:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答

kk26

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 谢谢，同勉 2012-10-12 22:34:40
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-13 16:30:16
做过以未连入片段的质粒为模板的阴性对照PCR吗？怀疑你没有连入片段，pcr筛菌出来的并非阳性克隆。

我目前也筛不到阳性克隆，同样郁闷，继续做做！
同祝好运！
赞一下 回复此楼
2楼2012-10-12 17:28:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+3, 谢谢 2012-10-12 22:35:36
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-13 16:30:30
应该是载体酶切不完全（没有完全进行双酶切）。不知道你用的是什么酶。不同酶的用量会差5-30倍。你可以用double digestion designer设计你的酶切实验，确保载体酶切完全，基本没有背景克隆。你可以在小木虫上搜到的。祝好运。
赞一下 回复此楼
3楼2012-10-12 20:32:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

faile18

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 引物是一样的，正在改变酶切条件 2012-10-13 10:26:32
小丹木木: 金币+3, 光路交流 2012-10-13 16:30:40
小丹木木: 操作失误，不好意思 2012-10-13 16:31:02
有点疑问，也有点小建议：
1. 可以考虑蓝白斑筛选，初步滤掉空载体，白色克隆PCR检测，（这里有个疑问，你PCR验证时说引物自己设计，不知道你这对引物与你之前PCR扩增3K片段时是否一样，如果不一样可以考虑用那对引物扩增来检测一下）。
2. 确定下质粒双酶切体系是否兼容，比如buffer，酶用量等都会有影响。
3. 你的载体自身是否work？
祝好运。
赞一下 回复此楼
4楼2012-10-13 04:15:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 105500药学求调剂 +4 x_skys 2026-04-12 4/200 2026-04-14 13:37 by rndfc
[考研] 化学070300 求调剂 +21 哈哈哈^_^ 2026-04-12 21/1050 2026-04-13 21:36 by nxybio2007
[考研] 266调剂 +10 daya sun 2026-04-07 11/550 2026-04-13 10:12 by fenglj492
[考研] 。 +10 李多米lee. 2026-04-12 11/550 2026-04-12 22:58 by yuyin1233
[考研] 295分求调剂 +13 ?要上岸? 2026-04-10 13/650 2026-04-12 15:37 by laoshidan
[考研] 270求调剂 +14 杨乐369 2026-04-11 14/700 2026-04-11 20:16 by 蓝云思雨
[考研] 本人女孩 +7 吼吼， 2026-04-10 9/450 2026-04-11 14:45 by ACS Nano——
[考研] 085402通信工程调剂，有4项学科竞赛国奖（电赛国二），硕士研究生调剂自荐信。 +5 m永o不v言o弃m 2026-04-09 5/250 2026-04-11 09:33 by zhq0425
[考研] 346，工科0854求调剂，专硕 +7 moser233 2026-04-10 8/400 2026-04-11 08:52 by 猪会飞
[考研] 调剂 化学 307 +21 73372112 2026-04-09 23/1150 2026-04-10 23:53 by wj165256
[考研] 一志愿北理工298英一数二已上岸，感谢各位老师 +14 Reframe 2026-04-10 16/800 2026-04-10 23:07 by caotw2020
[考研] 调剂 +12 卷卷卷心菜_ 2026-04-09 13/650 2026-04-10 22:36 by Ftglcn90
[考研] 368求调剂 +3 17385968172 2026-04-10 3/150 2026-04-10 20:12 by 电子奥德彪
[考研] 中科院总分315求调剂 +8 lallalh 2026-04-09 8/400 2026-04-10 19:30 by dick_runner
[考研] 初试261 +3 Asht少 2026-04-10 6/300 2026-04-10 16:38 by Asht少
[考研] 282，电气工程专业，求调剂，不挑专业 +9 jggshjkkm 2026-04-10 9/450 2026-04-10 14:55 by 逆水乘风
[考研] 已调剂 +18 柴郡猫_ 2026-04-09 19/950 2026-04-09 22:10 by 柴郡猫_
[考研] 332，085601求调剂 +12 ydfyh 2026-04-09 14/700 2026-04-09 17:28 by wp06
[考研] 化学工程与技术专业一志愿哈工程 291分B区 国家级大创负责人 有一作论文 +13 Emmy~ 2026-04-09 13/650 2026-04-09 14:47 by only周
[考研] 307求调剂 +3 Youth@@ 2026-04-07 3/150 2026-04-07 22:00 by hemengdong
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭