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fxj1986

木虫 (正式写手)


[交流] 酶切酶连转化后单克隆检测不对

自己构建的载体,片段7K左右;片段(3k)通过PCR扩增;电泳后回收进行酶切,酶切条件37℃,3h;再电泳后回收,酶连时载体:片段=1:1.5左右,转化DH5α,16h(氯霉素抗性)平板上单克隆很多;挑取单克隆进行菌落PCR验证(引物为自己设计),电泳结果显示除了目的条带外还有其他条带;对单克隆培养重新提取质粒进行双酶切后,只检测出一条带(与质粒大小基本一致),没有片段的目的条带。几次转化都如此,求分析,求经验!
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kk26

木虫 (小有名气)


★ ★ ★ ★
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fxj1986: 金币+1, 谢谢,同勉 2012-10-12 22:34:40
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-13 16:30:16
做过以未连入片段的质粒为模板的阴性对照PCR吗?怀疑你没有连入片段,pcr筛菌出来的并非阳性克隆。

我目前也筛不到阳性克隆,同样郁闷,继续做做!
同祝好运!
2楼2012-10-12 17:28:17
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酶切专家

金虫 (小有名气)


★ ★ ★ ★ ★ ★
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fxj1986: 金币+3, 谢谢 2012-10-12 22:35:36
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-13 16:30:30
应该是载体酶切不完全(没有完全进行双酶切)。不知道你用的是什么酶。不同酶的用量会差5-30倍。你可以用double digestion designer设计你的酶切实验,确保载体酶切完全,基本没有背景克隆。你可以在小木虫上搜到的。祝好运。
3楼2012-10-12 20:32:41
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faile18

金虫 (小有名气)


★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 引物是一样的,正在改变酶切条件 2012-10-13 10:26:32
小丹木木: 金币+3, 光路交流 2012-10-13 16:30:40
小丹木木: 操作失误,不好意思 2012-10-13 16:31:02
有点疑问,也有点小建议:
1. 可以考虑蓝白斑筛选,初步滤掉空载体,白色克隆PCR检测,(这里有个疑问,你PCR验证时说引物自己设计,不知道你这对引物与你之前PCR扩增3K片段时是否一样,如果不一样可以考虑用那对引物扩增来检测一下)。
2. 确定下质粒双酶切体系是否兼容,比如buffer,酶用量等都会有影响。
3. 你的载体自身是否work?
祝好运。
4楼2012-10-13 04:15:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


★ ★
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fxj1986: 金币+1 2012-10-13 10:26:43
首先确保用的两个酶没问题。酶切完用碱性磷酸酶处理载体减少自连。菌落PCR时做负对照。
5楼2012-10-13 08:41:03
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j2

木虫 (正式写手)


★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 谢谢,正在调整比例 2012-10-13 10:27:03
载体本身也有抗性?还是抗生素失效?
可以考虑增大连接时目的基因的量
6楼2012-10-13 09:37:06
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zqp9110

金虫 (正式写手)


★ ★ ★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-13 16:31:14
fxj1986: 金币+1, 谢谢建议 2012-10-14 10:23:43
连接时插入片段和载体的比例可能要大一点才能增加连接效率吧。建议连接结束后把连接产物先进行电泳检测,看是否有插入了目的片段的完整载体,每一步都加入质控能减少不必要的工作量。
7楼2012-10-13 10:46:44
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20083630zhan

木虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by zqp9110 at 2012-10-13 10:46:44
连接时插入片段和载体的比例可能要大一点才能增加连接效率吧。建议连接结束后把连接产物先进行电泳检测,看是否有插入了目的片段的完整载体,每一步都加入质控能减少不必要的工作量。

这样也可以吗?连接产物本来就非常少,电泳能看出条带吗?
8楼2014-03-03 16:08:34
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
酶连时载体:片段=1:1.5????我们一般是载体:片段的摩尔数=1:3~1:10.
9楼2014-03-03 17:12:03
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