| 查看: 1814 | 回复: 11 | ||||
zhaoyu2881木虫 (正式写手)
|
[求助]
单酶切连接转化，感受态的问题？！
|
|
最近新做了一批DH5α感受态细胞，之后转pBS在LB (amp+)平板上验证了可用。于是做质粒酶切连接，试验如下： T1: pBS用EcoRV酶切后，插入目的基因；（insert / vecotor=3:1 or 5:1），转化； CK1 : pBS用EcoRV酶切后，T4 DNA ligase （Fermentas） 自连，转化；（为验证ligation reaction） CK2 ：直接转化pBS （为再次验证感受态细胞） 后在LB （amp+）上做蓝白斑筛选，可是每个平板上什么都不长了！？这可能是什么原因呢，现在能确定ligase应该没有问题，是新的。 感受态细胞也是验证过的，只是在验证后在4度下放置了一晚，第二天保存在-80度冰箱，请问会是因为这个原因影响了感受态的功能吗？想了很多原因，觉得操作应该没有问题，这可能是什么导致的呢？ 急盼各位有经验的前来指教！！谢谢！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 实验操作 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有70人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 易错PCR酶切与连接
已经有23人回复
- 关于目的基因与载体连接后转化感受态细胞提取质粒的问题。
已经有8人回复
- 酶切连接连不上，要死了
已经有23人回复
- 大质粒转化 感受态细胞问题
已经有23人回复
- 做完酶切，之后进行连接，转化，可是过夜之后平板上不长菌落，阴性对照也不长菌落
已经有6人回复
- Sac1和Xho1的双酶切连接
已经有5人回复
- 单酶切何时加CIP酶
已经有7人回复
- 急求酶切，回收及连接详细操作步骤
已经有10人回复
- 很奇怪的酶切连接问题
已经有13人回复
- 纠结的分子实验，双酶切连不上，求助
已经有14人回复
- 2.7Kb的片段连接问题
已经有6人回复
- 求助--双酶切连接构质粒
已经有15人回复
- 酶切、连接和转化
已经有9人回复
- 求助：质粒为什么转化感受态转不进去
已经有11人回复
- 有没有用过XmnI这个酶的?酶切后连接需要注意什么问题么？
已经有12人回复
- 单酶切的大片段连接转化及多个片段的连接转化问题
已经有8人回复
- 双酶切之后，线状质粒的连接问题
已经有13人回复
- （侯氏出品）双酶切连接反应之全攻略
已经有89人回复
- 酶切后未纯化连接出现的问题
已经有18人回复
guoxingliu
木虫 (小有名气)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 1395.4
- 红花: 1
- 帖子: 228
- 在线: 59.7小时
- 虫号: 1105004
- 注册: 2010-09-21
- 专业: 环境微生物学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+2, 谢谢你的回答。我是新做好的质粒验证能用后，在4度放了一晚，然后就一直在-80下保存了，恩，我现在也担心是不是感受态的问题？ 2012-10-21 10:38:55
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-22 13:34:45
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+2, 谢谢你的回答。我是新做好的质粒验证能用后，在4度放了一晚，然后就一直在-80下保存了，恩，我现在也担心是不是感受态的问题？ 2012-10-21 10:38:55
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-22 13:34:45
| 看了您的实验方案，没什么问题，如果酶切操作、DNA片段的回收都没什么问题，建议重新转化（取来自超低温冷冻的感受态，随取随用），我的经验，放在4℃是绝对不行的，感受态在超低温冰箱冷冻后，都是比较脆弱的，放在4℃条件下保存，肯定影响其效率（我们做的感受态都是放在-150℃保存）。 |
2楼2012-10-21 08:58:54
3楼2012-10-21 09:13:55
tulip1213
银虫 (小有名气)
- 应助: 16 (小学生)
- 金币: 577.4
- 帖子: 134
- 在线: 24.1小时
- 虫号: 34368
- 注册: 2004-01-08
- 性别: MM
- 专业: 植物生理与生化
4楼2012-10-21 10:32:17
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
5楼2012-10-21 13:34:58
xj0311
木虫 (小有名气)
- 应助: 42 (小学生)
- 金币: 2112.1
- 帖子: 119
- 在线: 28.5小时
- 虫号: 1790392
- 注册: 2012-05-02
- 性别: GG
- 专业: 病原微生物变异与耐药
6楼2012-10-21 16:11:23
|
本帖内容被屏蔽 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
zhaoyu28817楼2012-10-21 16:42:53
小小技术官
木虫 (正式写手)
- 应助: 39 (小学生)
- 金币: 4529.4
- 散金: 248
- 红花: 6
- 帖子: 768
- 在线: 232.5小时
- 虫号: 1972611
- 注册: 2012-09-04
- 性别: GG
- 专业: 常微分方程与动力系统
8楼2012-10-21 18:28:19
zhaoyu2881
木虫 (正式写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 2026.3
- 散金: 25
- 红花: 3
- 沙发: 1
- 帖子: 757
- 在线: 302.3小时
- 虫号: 640168
- 注册: 2008-10-29
- 专业: 微生物资源与分类学
9楼2012-10-21 22:53:37
wt3532
木虫 (著名写手)
涛声依旧
- 应助: 73 (初中生)
- 金币: 13854.4
- 红花: 6
- 帖子: 1340
- 在线: 364.4小时
- 虫号: 940728
- 注册: 2010-01-11
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+3, 恩，非常感谢！看了大家的建议，回想了下实验操作，感觉还是有些小的细节没有注意到~~打算重新再做了，呼呼~~ 2012-10-23 04:42:35
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+3, 恩，非常感谢！看了大家的建议，回想了下实验操作，感觉还是有些小的细节没有注意到~~打算重新再做了，呼呼~~ 2012-10-23 04:42:35
|
自己做的感受态，做好后直接分装放-80冰箱保存。用的时候取一管做，如果要验证感受态问题，取两管，一管做转化的，一个做对照。基本上以我的经验说，自己制作感受态只是效率问题，有的人做的感受态板子上可能找的密密麻麻的好多，有的只是张100个或者很少的几个，但基本上都说阳性的。 还有感受态不管是自作还是转化，除了热激过程，都说需要冰上操作的。 以前见有的人说，这个冰上操作甚至比无菌更重要（离心、悬浮等操作）。如果没有冷冻离心机，我们之前是将小转子放-20冰箱里冻冷，然后缩短离心时间和离心转速，也能制成很好的感受态 |
10楼2012-10-22 18:21:23
