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zhaoyu2881

木虫 (正式写手)

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[求助] 单酶切连接转化，感受态的问题？！

最近新做了一批DH5α感受态细胞，之后转pBS在LB (amp+)平板上验证了可用。于是做质粒酶切连接，试验如下：
T1: pBS用EcoRV酶切后，插入目的基因；（insert / vecotor=3:1 or 5:1），转化；
CK1 : pBS用EcoRV酶切后，T4 DNA ligase （Fermentas）自连，转化；（为验证ligation reaction）
CK2 ：直接转化pBS （为再次验证感受态细胞）
后在LB （amp+）上做蓝白斑筛选，可是每个平板上什么都不长了！？这可能是什么原因呢，现在能确定ligase应该没有问题，是新的。

感受态细胞也是验证过的，只是在验证后在4度下放置了一晚，第二天保存在-80度冰箱，请问会是因为这个原因影响了感受态的功能吗？想了很多原因，觉得操作应该没有问题，这可能是什么导致的呢？

急盼各位有经验的前来指教！！谢谢！

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Thatislife,onlylifehurts.

1楼 2012-10-21 03:39:52

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wt3532

木虫 (著名写手)

涛声依旧

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
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zhaoyu2881: 金币+3, 恩，非常感谢！看了大家的建议，回想了下实验操作，感觉还是有些小的细节没有注意到~~打算重新再做了，呼呼~~ 2012-10-23 04:42:35

自己做的感受态，做好后直接分装放-80冰箱保存。用的时候取一管做，如果要验证感受态问题，取两管，一管做转化的，一个做对照。基本上以我的经验说，自己制作感受态只是效率问题，有的人做的感受态板子上可能找的密密麻麻的好多，有的只是张100个或者很少的几个，但基本上都说阳性的。
还有感受态不管是自作还是转化，除了热激过程，都说需要冰上操作的。
以前见有的人说，这个冰上操作甚至比无菌更重要（离心、悬浮等操作）。如果没有冷冻离心机，我们之前是将小转子放-20冰箱里冻冷，然后缩短离心时间和离心转速，也能制成很好的感受态

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10楼2012-10-22 18:21:23

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