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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 很奇怪的酶切连接问题
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33ggdf

新虫 (小有名气)

[求助] 很奇怪的酶切连接问题

我分别双酶切表达载体和T-载体，再分别回收目的片段（16000bp和1100bp），在连接热击转化，挑取单克隆，pcr验证，挑阳性测序，测序结果正确（因为表达载体没有通用引物，所以就用的自己的目的片段的引物测序，据师兄说这样测序开头和结尾是不准确的，中间的序列才有说服力，测序的结果表明中间的序列确实是我目的片段上的序列，因此我觉得我连接成功了，这样理解不知对不对？），可奇怪的是：我再双酶切重组质粒时却切不下来了，试了好几次，也试着改变酶切体系，可还是不行，没有目的条带，只有质粒一条带，求解。。。。。。。。
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1楼 2013-06-30 14:43:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
33ggdf: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-07-07 10:56:33
1. 建议你重新合成测序的印物，位置在你的序列上游30~50bp
2. 你用的是什么酶联接呢？而且做完ligation后转化的细胞是哪一种e.coli?
3. 考虑其他的在plasmid上的位点切一下
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11楼2013-07-04 17:01:04
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普通回帖

bleach060452

新虫 (小有名气)
质粒的一条带是线性，还是环？
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岂能尽如人意，但求无愧我心
2楼2013-06-30 14:54:05
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透明的玻璃杯

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
33ggdf: 金币+3 2013-07-01 11:20:00
重新测序一下，表达载体没有引物就合成一下也很快的。
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皇帝诞生地
3楼2013-06-30 21:01:26
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flyy1986

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物版块 期待你的精彩和更详细的解答。 2013-07-01 11:23:29
测序结果能找到酶切位点么？或者试试其他的酶。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2013-06-30 23:26:52
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币-1, 应助指数-1, 与应助无关的内容，请勿点击应助按钮，否则一律视为刷应助指数。分子生物期待你的积极交流 2013-07-01 11:23:04
33ggdf(myprayer代发): 金币+1, 再三斟酌，此贴回复还是缺少一点实质性的东西，zhlf1989513能补充相关的应助信息则最好不过了，分子生物版块期待你的积极交流 2013-07-01 11:25:47
这个问题我也遇见过，不知道楼主解决否？可否讨教下~~~
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keepon
5楼2013-07-01 08:00:18
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
测序能看到酶切位点不，酶验证过能用不？
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6楼2013-07-01 11:15:49
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33ggdf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 透明的玻璃杯 at 2013-06-30 21:01:26
重新测序一下，表达载体没有引物就合成一下也很快的。

也只能如此了
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7楼2013-07-01 11:18:01
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cxwu10016869

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
在已知的外源基因上设计引物，将整个外源基因序列测通。
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8楼2013-07-01 21:56:18
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33ggdf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-07-01 08:00:18
这个问题我也遇见过，不知道楼主解决否？可否讨教下~~~

未解决，个人觉得很可能没连上，你现在是什么情况
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9楼2013-07-04 10:32:23
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水水613

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

会不会是酶切位点甲基化，实验室有人出现类似情况

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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10楼2013-07-04 14:18:13
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