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zhaoyu2881木虫 (正式写手)
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[求助]
单酶切连接转化，感受态的问题？！
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最近新做了一批DH5α感受态细胞，之后转pBS在LB (amp+)平板上验证了可用。于是做质粒酶切连接，试验如下： T1: pBS用EcoRV酶切后，插入目的基因；（insert / vecotor=3:1 or 5:1），转化； CK1 : pBS用EcoRV酶切后，T4 DNA ligase （Fermentas） 自连，转化；（为验证ligation reaction） CK2 ：直接转化pBS （为再次验证感受态细胞） 后在LB （amp+）上做蓝白斑筛选，可是每个平板上什么都不长了！？这可能是什么原因呢，现在能确定ligase应该没有问题，是新的。 感受态细胞也是验证过的，只是在验证后在4度下放置了一晚，第二天保存在-80度冰箱，请问会是因为这个原因影响了感受态的功能吗？想了很多原因，觉得操作应该没有问题，这可能是什么导致的呢？ 急盼各位有经验的前来指教！！谢谢！ |
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 实验操作 |
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wt3532
木虫 (著名写手)
涛声依旧
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+3, 恩，非常感谢！看了大家的建议，回想了下实验操作，感觉还是有些小的细节没有注意到~~打算重新再做了，呼呼~~ 2012-10-23 04:42:35
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+3, 恩，非常感谢！看了大家的建议，回想了下实验操作，感觉还是有些小的细节没有注意到~~打算重新再做了，呼呼~~ 2012-10-23 04:42:35
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自己做的感受态，做好后直接分装放-80冰箱保存。用的时候取一管做，如果要验证感受态问题，取两管，一管做转化的，一个做对照。基本上以我的经验说，自己制作感受态只是效率问题，有的人做的感受态板子上可能找的密密麻麻的好多，有的只是张100个或者很少的几个，但基本上都说阳性的。 还有感受态不管是自作还是转化，除了热激过程，都说需要冰上操作的。 以前见有的人说，这个冰上操作甚至比无菌更重要（离心、悬浮等操作）。如果没有冷冻离心机，我们之前是将小转子放-20冰箱里冻冷，然后缩短离心时间和离心转速，也能制成很好的感受态 |
10楼2012-10-22 18:21:23
guoxingliu
木虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+2, 谢谢你的回答。我是新做好的质粒验证能用后，在4度放了一晚，然后就一直在-80下保存了，恩，我现在也担心是不是感受态的问题？ 2012-10-21 10:38:55
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-22 13:34:45
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zhaoyu2881: 金币+2, 谢谢你的回答。我是新做好的质粒验证能用后，在4度放了一晚，然后就一直在-80下保存了，恩，我现在也担心是不是感受态的问题？ 2012-10-21 10:38:55
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-22 13:34:45
| 看了您的实验方案，没什么问题，如果酶切操作、DNA片段的回收都没什么问题，建议重新转化（取来自超低温冷冻的感受态，随取随用），我的经验，放在4℃是绝对不行的，感受态在超低温冰箱冷冻后，都是比较脆弱的，放在4℃条件下保存，肯定影响其效率（我们做的感受态都是放在-150℃保存）。 |
2楼2012-10-21 08:58:54
3楼2012-10-21 09:13:55
tulip1213
银虫 (小有名气)
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4楼2012-10-21 10:32:17
10