应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助--双酶切连接构质粒
161/2返回列表12下一页
查看: 2439  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

corner_g

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助--双酶切连接构质粒

各位大虾，SOS ::>_<::
要构建一个质粒，大片段3200，小片段800。大片段是从4300的质粒上用SpeI和BglII双酶切切下来的，电泳检测片段大小没有问题，胶回收。小片段是从另一个质粒上PCR扩出来的，引物导入的酶切位点，一边一个，分别是SpeI和BglII，方向不会错，将PCR产物双酶切回收。然后连接，用的T4，连不上。后来将小片段先连到T载上，然后双酶切，电泳检测，切下来了，胶回收后用T4连接，还是连不上，然后放弃T4用T载试剂盒的solutionI连接，还是连不上。。。。。。感受态没问题。操作也没问题。做了有一个月了。。大家有没有碰到类似的情况呀？给点主意吧。。谢谢啦~新人木有钱- -

[ Last edited by 1949stone on 2013-6-9 at 14:20 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-05-13 14:38:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangxin320

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连不上的意思是转化没长斑还是转化长斑都是阴性？
赞一下 回复此楼
2楼2013-05-13 17:57:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

desheng101

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
片段回收量怎么样，连接比例呢。抗性对不对。你所说的没问题不一定真的没问题，把所有的完整考虑一边
赞一下 回复此楼
3楼2013-05-13 19:11:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-20 08:32:26
回收片段定量，连接时按比例加载体和插入片段。胶回收时不要在紫外灯下照太久。
赞一下 回复此楼
4楼2013-05-14 08:31:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Tporker

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
corner_g(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-15 03:25:28
将小片段先连到T载上，然后双酶切，电泳检测，切下来了；说明你的片段没有问题，那就是载体的问题了！建议你用SpeI和BglII分别单切载体，看看是不是某个酶切位点有问题！
赞一下 回复此楼
值，夜渐浓，闻窗外蛙鸣，辗转无眠难入梦；此，风渐清，听庭内雨应，悱恻浮醒忆青笼。
5楼2013-05-14 16:37:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by Tporker at 2013-05-14 16:37:01
将小片段先连到T载上，然后双酶切，电泳检测，切下来了；说明你的片段没有问题，那就是载体的问题了！建议你用SpeI和BglII分别单切载体，看看是不是某个酶切位点有问题！

不大像, 楼主描述了, 载体片段也是从一个更大的载体上切下来的, 如果出问题的话割胶回收时就发现不对了.
赞一下 回复此楼
6楼2013-05-14 17:05:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

corner_g

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangxin320 at 2013-05-13 17:57:26
连不上的意思是转化没长斑还是转化长斑都是阴性？

没有长斑，有其中一次长了2个，都是阴性。
赞一下 回复此楼
7楼2013-05-17 09:52:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

corner_g

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by desheng101 at 2013-05-13 19:11:58
片段回收量怎么样，连接比例呢。抗性对不对。你所说的没问题不一定真的没问题，把所有的完整考虑一边

抗性，比例，回收量应该都可以，因为已经在实验室组会上讨论过好多次了。- -。。目前正在加大片段量重做。。3Q
赞一下 回复此楼
8楼2013-05-17 09:54:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

corner_g

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-14 08:31:07
回收片段定量，连接时按比例加载体和插入片段。胶回收时不要在紫外灯下照太久。

嗯，之前都是根据胶图亮度大概估算，，这次要做个定量。谢谢啦
赞一下 回复此楼
9楼2013-05-17 09:55:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

corner_g

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Tporker at 2013-05-14 16:37:01
将小片段先连到T载上，然后双酶切，电泳检测，切下来了；说明你的片段没有问题，那就是载体的问题了！建议你用SpeI和BglII分别单切载体，看看是不是某个酶切位点有问题！

嗯。做来做去只能在酶切上面找原因了。现在正在分步酶切。至于酶切位点我最开始就查过了。谢谢建议！
赞一下 回复此楼
10楼2013-05-17 09:57:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 corner_g 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 0XLacIJUOj8D 2026-08-24 6/300 2026-08-25 00:11 by BZKMTicpDhFj
[基金申请] 明天应该可查了！？ +5 chengyan1220 2026-08-23 5/250 2026-08-24 23:28 by 我4大白菜
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +7 图啦图啦 2026-08-24 8/400 2026-08-24 22:00 by maomao_da
[基金申请] 我面上完蛋了 +9 且听虎啸 2026-08-20 10/500 2026-08-24 20:08 by 苦寒来香
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +17 羊腰板 2026-08-21 19/950 2026-08-24 16:52 by iaeyuan
[基金申请] 估计是周四 +4 archvillain 2026-08-18 4/200 2026-08-24 13:53 by zzuzxg
[基金申请] 朋友圈看到的 +7 wangzilk 2026-08-18 9/450 2026-08-24 10:50 by cmrandy
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +13 大萍1987 2026-08-20 16/800 2026-08-24 10:23 by 太傻了
[基金申请] 放榜前的不淡定 20+4 snowwithsea 2026-08-19 17/850 2026-08-24 10:20 by echo8914667
[基金申请] 科研孤儿太难了 +18 我4大白菜 2026-08-20 19/950 2026-08-24 09:47 by 凯恩广盛催化分�
[基金申请] 什么时候开奖？ +10 CrisMessi 2026-08-18 11/550 2026-08-24 06:50 by 开心的小狮子
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭