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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助--双酶切连接构质粒
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corner_g

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-14 17:05:31
不大像, 楼主描述了, 载体片段也是从一个更大的载体上切下来的, 如果出问题的话割胶回收时就发现不对了....

恩~对的撒~不知道会不会遇到酶切位点突变而且跟我的目的微点就差几十bp的奇葩事件。。。。。谢啦~
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11楼2013-05-17 09:58:16
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Tporker

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by corner_g at 2013-05-17 09:57:17
嗯。做来做去只能在酶切上面找原因了。现在正在分步酶切。至于酶切位点我最开始就查过了。谢谢建议！...

PCR之后直接连接进入T载体，然后再双酶切质粒回收目的片段，将目的片段与目标载体连接。
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值，夜渐浓，闻窗外蛙鸣，辗转无眠难入梦；此，风渐清，听庭内雨应，悱恻浮醒忆青笼。
12楼2013-05-20 08:28:34
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匿名

用户注销 (小有名气)
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13楼2013-05-20 08:42:18
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by corner_g at 2013-05-17 09:52:13
没有长斑，有其中一次长了2个，都是阴性。...

你平板上长得斑太少了，应该是你连接体系以及转化过程中的问题
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14楼2013-06-09 09:43:00
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molidawa

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是用的自己做的感受态还是商业化的感受态？连接产物先往商业化感受态细胞中转， 效率高
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15楼2013-06-09 11:15:04
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

用T4 DNA连接酶连接后转化失败的可能原因与对策：
（1）反应体系内无ATP或Mg2+
    对策：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer
保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。
（2）反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高  对策：纯化DNA
（3）去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底
    对策：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。
（4）DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA  
对策：保持总DNA浓度在1-10μg/ml之间。
（5）连接末端为单碱基突出末端
    对策：使用最高至5μL高浓度连接酶16°C过夜连接。
（6）插入片段和质粒没有磷酸化。注重：假如载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化
会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。
（7）加入过多的连接混合物至感受态细胞  
对策：50μL感受态细胞应加入1-5μL连接混合物。
（8）插入片段太大，不能进行环化
对策：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。
（9）连接酶失活  对策：用lambda HindIII或其它可行的底物进行检测。

别人告诉我的，参考一下了。
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16楼2013-06-09 11:41:15
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