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corner_g

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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专业: 生物物理、生物化学与分子

[求助] 求助--双酶切连接构质粒

各位大虾，SOS ::>_<::
要构建一个质粒，大片段3200，小片段800。大片段是从4300的质粒上用SpeI和BglII双酶切切下来的，电泳检测片段大小没有问题，胶回收。小片段是从另一个质粒上PCR扩出来的，引物导入的酶切位点，一边一个，分别是SpeI和BglII，方向不会错，将PCR产物双酶切回收。然后连接，用的T4，连不上。后来将小片段先连到T载上，然后双酶切，电泳检测，切下来了，胶回收后用T4连接，还是连不上，然后放弃T4用T载试剂盒的solutionI连接，还是连不上。。。。。。感受态没问题。操作也没问题。做了有一个月了。。大家有没有碰到类似的情况呀？给点主意吧。。谢谢啦~新人木有钱- -

[ Last edited by 1949stone on 2013-6-9 at 14:20 ]

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1楼2013-05-13 14:38:19

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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

专家经验: +218
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性别: MM
专业: 生物大分子结构与功能
管辖: 生物科学综合

【答案】应助回帖

用T4 DNA连接酶连接后转化失败的可能原因与对策：
（1）反应体系内无ATP或Mg2+
对策：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer
保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。
（2）反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高  对策：纯化DNA
（3）去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底
对策：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。
（4）DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA
对策：保持总DNA浓度在1-10μg/ml之间。
（5）连接末端为单碱基突出末端
对策：使用最高至5μL高浓度连接酶16°C过夜连接。
（6）插入片段和质粒没有磷酸化。注重：假如载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化
会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。
（7）加入过多的连接混合物至感受态细胞
对策：50μL感受态细胞应加入1-5μL连接混合物。
（8）插入片段太大，不能进行环化
对策：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。
（9）连接酶失活  对策：用lambda HindIII或其它可行的底物进行检测。

别人告诉我的，参考一下了。