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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助--双酶切连接构质粒
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corner_g

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助--双酶切连接构质粒

各位大虾，SOS ::>_<::
要构建一个质粒，大片段3200，小片段800。大片段是从4300的质粒上用SpeI和BglII双酶切切下来的，电泳检测片段大小没有问题，胶回收。小片段是从另一个质粒上PCR扩出来的，引物导入的酶切位点，一边一个，分别是SpeI和BglII，方向不会错，将PCR产物双酶切回收。然后连接，用的T4，连不上。后来将小片段先连到T载上，然后双酶切，电泳检测，切下来了，胶回收后用T4连接，还是连不上，然后放弃T4用T载试剂盒的solutionI连接，还是连不上。。。。。。感受态没问题。操作也没问题。做了有一个月了。。大家有没有碰到类似的情况呀？给点主意吧。。谢谢啦~新人木有钱- -

[ Last edited by 1949stone on 2013-6-9 at 14:20 ]
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1楼 2013-05-13 14:38:19
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wangxin320

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连不上的意思是转化没长斑还是转化长斑都是阴性？
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2楼2013-05-13 17:57:26
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desheng101

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
片段回收量怎么样，连接比例呢。抗性对不对。你所说的没问题不一定真的没问题，把所有的完整考虑一边
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3楼2013-05-13 19:11:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-20 08:32:26
回收片段定量，连接时按比例加载体和插入片段。胶回收时不要在紫外灯下照太久。
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4楼2013-05-14 08:31:07
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Tporker

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
corner_g(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-15 03:25:28
将小片段先连到T载上，然后双酶切，电泳检测，切下来了；说明你的片段没有问题，那就是载体的问题了！建议你用SpeI和BglII分别单切载体，看看是不是某个酶切位点有问题！
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值，夜渐浓，闻窗外蛙鸣，辗转无眠难入梦；此，风渐清，听庭内雨应，悱恻浮醒忆青笼。
5楼2013-05-14 16:37:01
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by Tporker at 2013-05-14 16:37:01
将小片段先连到T载上，然后双酶切，电泳检测，切下来了；说明你的片段没有问题，那就是载体的问题了！建议你用SpeI和BglII分别单切载体，看看是不是某个酶切位点有问题！

不大像, 楼主描述了, 载体片段也是从一个更大的载体上切下来的, 如果出问题的话割胶回收时就发现不对了.
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6楼2013-05-14 17:05:31
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corner_g

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangxin320 at 2013-05-13 17:57:26
连不上的意思是转化没长斑还是转化长斑都是阴性？

没有长斑，有其中一次长了2个，都是阴性。
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7楼2013-05-17 09:52:13
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corner_g

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by desheng101 at 2013-05-13 19:11:58
片段回收量怎么样，连接比例呢。抗性对不对。你所说的没问题不一定真的没问题，把所有的完整考虑一边

抗性，比例，回收量应该都可以，因为已经在实验室组会上讨论过好多次了。- -。。目前正在加大片段量重做。。3Q
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8楼2013-05-17 09:54:10
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corner_g

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-14 08:31:07
回收片段定量，连接时按比例加载体和插入片段。胶回收时不要在紫外灯下照太久。

嗯，之前都是根据胶图亮度大概估算，，这次要做个定量。谢谢啦
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9楼2013-05-17 09:55:21
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corner_g

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Tporker at 2013-05-14 16:37:01
将小片段先连到T载上，然后双酶切，电泳检测，切下来了；说明你的片段没有问题，那就是载体的问题了！建议你用SpeI和BglII分别单切载体，看看是不是某个酶切位点有问题！

嗯。做来做去只能在酶切上面找原因了。现在正在分步酶切。至于酶切位点我最开始就查过了。谢谢建议！
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10楼2013-05-17 09:57:17
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