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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 求助：EcoRI 和 XhoI双酶切
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rendan911117

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助：EcoRI 和 XhoI双酶切 已有12人参与

我双酶切用的酶  XhoI是赛默飞的  EcoRI是生工的  做了好多次  连接之后转化一直提不出质粒    两个酶能一起双酶切吗  如果可以 Buffer用哪个比较好啊   有没有做过这两个酶双酶切的啊  求指教 拜托啦
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1楼 2014-09-19 10:06:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-10-04 19:14:11
不同公司的最好不要一起切，因为有时候他们的buffer虽然名字一样，可是不是一样的东西。
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2楼2014-09-19 10:22:52
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

2× Tango buffer
EcoR I
Xho I
37℃
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12楼2014-09-22 14:44:21
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pc012351

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
rendan911117(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-04 22:05:36
可以做双酶切没问题，不同公司的我也混用过，挺好用的，回收的片段在跑次电泳能看见条带后面连接就不会有问题了
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13楼2014-09-22 15:15:18
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普通回帖

非常6+1

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-19 12:28:10
两个不同公司的酶一起切问题不大，很有可能是你连接失败了，你完全可以先菌落PCR验证一下你的连接产物转化是否成功。转化成功了，不可能质粒提不出。若转化失败，可以考虑都用赛默飞的酶双切。
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3楼2014-09-19 10:54:21
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rendan911117

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 非常6+1 at 2014-09-19 10:54:21
两个不同公司的酶一起切问题不大，很有可能是你连接失败了，你完全可以先菌落PCR验证一下你的连接产物转化是否成功。转化成功了，不可能质粒提不出。若转化失败，可以考虑都用赛默飞的酶双切。

我之前菌落PCR 有的有条带有的没有   然后提质粒的时候没提出来…  一个体系  载体和目的基因的比例试了很多    但是都没有提出质粒…
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4楼2014-09-19 16:37:04
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rendan911117

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-09-19 10:22:52
不同公司的最好不要一起切，因为有时候他们的buffer虽然名字一样，可是不是一样的东西。

好的   我之前两种酶酶切用的tango buffer    酶切之后条带也和想要的差不多  但是连接不成功   怀疑可能是酶切的问题
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5楼2014-09-19 16:39:35
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by rendan911117 at 2014-09-19 16:39:35
好的   我之前两种酶酶切用的tango buffer    酶切之后条带也和想要的差不多  但是连接不成功   怀疑可能是酶切的问题...

恩
6楼2014-09-20 09:56:47
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小小c的123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-22 17:01:03
看你的表述，应该是从酶切开始，构建重组质粒，然后转化，最后提质粒验证...最终的结果是提不出质粒，个人感觉情况还是蛮多的...酶切来说，一般是不推荐不同公司的酶进行同体系双酶切的，最好是同家公司，按照说明书上的双酶切体系...至于你提不出质粒，是转化板不长，还是有阳性克隆夸大培养之后提不出质粒呢?
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7楼2014-09-21 11:06:25
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rendan911117

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小小c的123 at 2014-09-21 11:06:25
看你的表述，应该是从酶切开始，构建重组质粒，然后转化，最后提质粒验证...最终的结果是提不出质粒，个人感觉情况还是蛮多的...酶切来说，一般是不推荐不同公司的酶进行同体系双酶切的，最好是同家公司，按照说明书 ...

我现在也还没有弄清楚提不出质粒的原因  所以很着急   今天又进行酶切  我总觉得是没有用一家的酶  所以酶切会有问题…
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8楼2014-09-21 15:24:29
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jiaowenqiang

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分步酶切吧，多做两管然后回收
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9楼2014-09-22 09:56:46
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liuzx984

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

直接选择TAKARA的，这两个酶效很高，用1XH的buffer 酶切2hr，效果很好，屡试不爽！
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10楼2014-09-22 10:19:59
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