应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pPIC9表达质粒XhoI/EcoRI双酶切
81/1返回列表
查看: 3866  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

sweet561

银虫 (小有名气)

[求助] pPIC9表达质粒XhoI/EcoRI双酶切 已有2人参与

请问一下，我现在做pPIC9表达质粒构建，连上200bp目的片段，并做了PCR和测序鉴定，都是正确的。但现在用XhoI和EcoRI双酶切，除了切出pPIC9、200bp的目的条带外，在1000-2000bp处还有一条弱弱的条带，不知道是怎么回事，我已经检查了质粒里都分别只有一个XhoI和EcoRI的酶切位点，那这个表达质粒算是构建成功了吗，直接线性化做表达的话会有什么影响吗？请各位高手指点。谢谢！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-05-19 10:23:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rv1nm2y

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不放心的话测序看看。
赞一下 回复此楼
2楼2014-05-19 16:20:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是酶切酶连构建的重组质粒还是反向PCR构建的？你测序是用的通用引物还是自己的引物？如果是酶切酶连，测序用的通用引物那就没啥问题，杂带是酶切条件不好导致的非特异切割，不影响你的线性化。
还有pPIC9和你的基因大小差别太大，做双酶切验证效果很差，既然有PCR和测序验证，就不需要做酶切验证了。
赞一下(1人) 回复此楼
大家相互帮助哈
3楼2014-05-19 20:19:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sweet561

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-19 20:19:27
是酶切酶连构建的重组质粒还是反向PCR构建的？你测序是用的通用引物还是自己的引物？如果是酶切酶连，测序用的通用引物那就没啥问题，杂带是酶切条件不好导致的非特异切割，不影响你的线性化。
还有pPIC9和你的基因 ...

谢谢！只是我还要换酶切位点，再将目的基因转到pPIC9K里，之后pPIC9K-目的基因，也是用PCR、测序验证没问题，就是双酶切有另外一条非特异条带，是酶切酶连，而且是通用引物，就是害怕之后直接线性化会有问题。
赞一下 回复此楼
4楼2014-05-20 16:49:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sweet561 at 2014-05-20 16:49:25
谢谢！只是我还要换酶切位点，再将目的基因转到pPIC9K里，之后pPIC9K-目的基因，也是用PCR、测序验证没问题，就是双酶切有另外一条非特异条带，是酶切酶连，而且是通用引物，就是害怕之后直接线性化会有问题。...

pPIC9K上的xhoI可不是一个酶切位点。多克隆位点内和多克隆位点上游都存在一个XhoI酶切位点，如果你构建出来的9K用ECoRI和XHOI切出来3条带很正常。不用担心，线性化后做一下检测，只要大小正确没啥问题。
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
5楼2014-05-20 19:37:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sweet561

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-20 19:37:55
pPIC9K上的xhoI可不是一个酶切位点。多克隆位点内和多克隆位点上游都存在一个XhoI酶切位点，如果你构建出来的9K用ECoRI和XHOI切出来3条带很正常。不用担心，线性化后做一下检测，只要大小正确没啥问题。...

谢谢，我现在用BamHI和EcoRI将pPIC9上的目的基因转到pPIC9K上，所以用BamHI和EcoRI先双酶切pPIC9K，发现是三条带的情况，之前没管它，直接回收了大片段，然后连接了目的基因，而且，线性化后电泳检测是10000左右大小的条带，与理论大小也相似，就是不太放心，希望能明确一下到底可不可以直接这样电转。
赞一下 回复此楼
6楼2014-05-21 10:18:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

pPIC9K的BamHI位点在α-signal sequence前面，整个质粒上还有几个和酶识别位点差一个碱基的位点，如果酶切条件不合适都可能切出来，如果酶切不完全质粒的超螺旋没去除干净也会出现条带，只要你用通用引物测序正确就说明你的基因连在了正确的位置上，你双酶切回收的片段也是正确的，如果回收的片段不对的话首先你很难连上，就算连上大小也不对，测序不是多克隆位点里没东西就是扩增不出来条带。现在的结果不影响你后期的线性化。
还有LZ你把9K的信号肽切掉了难道是想胞内表达？
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
7楼2014-05-21 14:36:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sweet561

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-21 14:36:14
pPIC9K的BamHI位点在α-signal sequence前面，整个质粒上还有几个和酶识别位点差一个碱基的位点，如果酶切条件不合适都可能切出来，如果酶切不完全质粒的超螺旋没去除干净也会出现条带，只要你用通用引物测序正确就 ...

哦，因为我的目的基因先是连在pPIC9上，然后再用BamHI和EcoRI将目的片段从pPIC9上切下，再连到pPIC9K上的，所以pPIC9K上切掉的信号肽，会跟目的基因连接后补上。
赞一下 回复此楼
8楼2014-05-21 16:37:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 sweet561 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 6/300 2026-08-08 10:19 by 3OOjAIS77qg2
[基金申请] fileCode有新解读？ +8 Tide man 2026-08-08 16/800 2026-08-08 09:59 by Tide man
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 4/200 2026-08-08 08:27 by 6vVgjDL4CnGu
[基金申请] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 KXLV3nuBVBY7 2026-08-07 4/200 2026-08-08 08:21 by 6vVgjDL4CnGu
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 3/150 2026-08-08 03:47 by 6vVgjDL4CnGu
[基金申请] 基金中了 +14 laoda193707 2026-08-06 14/700 2026-08-08 00:23 by 实验小白ha
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变，有变的大神么？ +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] 听说今天filecode变了 +24 布布和一二 2026-08-06 47/2350 2026-08-07 16:02 by zhiyanjiang
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
[论文投稿] 十年后又回来了，论文投稿求助 +4 哈哈114477 2026-08-01 4/200 2026-08-07 14:39 by jgy194592
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 求各位大神看下 100+6 hpkpkpkp 2026-08-05 33/1650 2026-08-06 14:49 by zhiyanjiang
[基金申请] 影响面上的因素 +8 布布和一二 2026-08-05 11/550 2026-08-06 10:41 by 宝贝虫子
[基金申请] 8月时间戳变的，举个手。玩一下，释放压力 +9 archvillain 2026-08-04 11/550 2026-08-05 20:06 by wlwhappy
[考博] 【2027博士申请】纳米药物递送方向 20+3 13586093586 2026-08-03 4/200 2026-08-05 09:59 by lfy8008
[基金申请] 纯娱乐，不喜欢勿喷 +7 Tide man 2026-08-04 10/500 2026-08-04 15:10 by loufangrui
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭