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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pPIC9表达质粒XhoI/EcoRI双酶切
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sweet561

银虫 (小有名气)

[求助] pPIC9表达质粒XhoI/EcoRI双酶切 已有2人参与

请问一下，我现在做pPIC9表达质粒构建，连上200bp目的片段，并做了PCR和测序鉴定，都是正确的。但现在用XhoI和EcoRI双酶切，除了切出pPIC9、200bp的目的条带外，在1000-2000bp处还有一条弱弱的条带，不知道是怎么回事，我已经检查了质粒里都分别只有一个XhoI和EcoRI的酶切位点，那这个表达质粒算是构建成功了吗，直接线性化做表达的话会有什么影响吗？请各位高手指点。谢谢！
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1楼 2014-05-19 10:23:02
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rv1nm2y

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不放心的话测序看看。
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2楼2014-05-19 16:20:10
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是酶切酶连构建的重组质粒还是反向PCR构建的？你测序是用的通用引物还是自己的引物？如果是酶切酶连，测序用的通用引物那就没啥问题，杂带是酶切条件不好导致的非特异切割，不影响你的线性化。
还有pPIC9和你的基因大小差别太大，做双酶切验证效果很差，既然有PCR和测序验证，就不需要做酶切验证了。
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3楼2014-05-19 20:19:27
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sweet561

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-19 20:19:27
是酶切酶连构建的重组质粒还是反向PCR构建的？你测序是用的通用引物还是自己的引物？如果是酶切酶连，测序用的通用引物那就没啥问题，杂带是酶切条件不好导致的非特异切割，不影响你的线性化。
还有pPIC9和你的基因 ...

谢谢！只是我还要换酶切位点，再将目的基因转到pPIC9K里，之后pPIC9K-目的基因，也是用PCR、测序验证没问题，就是双酶切有另外一条非特异条带，是酶切酶连，而且是通用引物，就是害怕之后直接线性化会有问题。
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4楼2014-05-20 16:49:25
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sweet561 at 2014-05-20 16:49:25
谢谢！只是我还要换酶切位点，再将目的基因转到pPIC9K里，之后pPIC9K-目的基因，也是用PCR、测序验证没问题，就是双酶切有另外一条非特异条带，是酶切酶连，而且是通用引物，就是害怕之后直接线性化会有问题。...

pPIC9K上的xhoI可不是一个酶切位点。多克隆位点内和多克隆位点上游都存在一个XhoI酶切位点，如果你构建出来的9K用ECoRI和XHOI切出来3条带很正常。不用担心，线性化后做一下检测，只要大小正确没啥问题。
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5楼2014-05-20 19:37:55
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sweet561

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-20 19:37:55
pPIC9K上的xhoI可不是一个酶切位点。多克隆位点内和多克隆位点上游都存在一个XhoI酶切位点，如果你构建出来的9K用ECoRI和XHOI切出来3条带很正常。不用担心，线性化后做一下检测，只要大小正确没啥问题。...

谢谢，我现在用BamHI和EcoRI将pPIC9上的目的基因转到pPIC9K上，所以用BamHI和EcoRI先双酶切pPIC9K，发现是三条带的情况，之前没管它，直接回收了大片段，然后连接了目的基因，而且，线性化后电泳检测是10000左右大小的条带，与理论大小也相似，就是不太放心，希望能明确一下到底可不可以直接这样电转。
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6楼2014-05-21 10:18:20
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

pPIC9K的BamHI位点在α-signal sequence前面，整个质粒上还有几个和酶识别位点差一个碱基的位点，如果酶切条件不合适都可能切出来，如果酶切不完全质粒的超螺旋没去除干净也会出现条带，只要你用通用引物测序正确就说明你的基因连在了正确的位置上，你双酶切回收的片段也是正确的，如果回收的片段不对的话首先你很难连上，就算连上大小也不对，测序不是多克隆位点里没东西就是扩增不出来条带。现在的结果不影响你后期的线性化。
还有LZ你把9K的信号肽切掉了难道是想胞内表达？
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7楼2014-05-21 14:36:14
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sweet561

银虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-21 14:36:14
pPIC9K的BamHI位点在α-signal sequence前面，整个质粒上还有几个和酶识别位点差一个碱基的位点，如果酶切条件不合适都可能切出来，如果酶切不完全质粒的超螺旋没去除干净也会出现条带，只要你用通用引物测序正确就 ...

哦，因为我的目的基因先是连在pPIC9上，然后再用BamHI和EcoRI将目的片段从pPIC9上切下，再连到pPIC9K上的，所以pPIC9K上切掉的信号肽，会跟目的基因连接后补上。
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8楼2014-05-21 16:37:36
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