应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pPIC9表达质粒XhoI/EcoRI双酶切
51/1返回列表
查看: 3505  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

sweet561

银虫 (小有名气)

[求助] pPIC9表达质粒XhoI/EcoRI双酶切 已有2人参与

请问一下，我现在做pPIC9表达质粒构建，连上200bp目的片段，并做了PCR和测序鉴定，都是正确的。但现在用XhoI和EcoRI双酶切，除了切出pPIC9、200bp的目的条带外，在1000-2000bp处还有一条弱弱的条带，不知道是怎么回事，我已经检查了质粒里都分别只有一个XhoI和EcoRI的酶切位点，那这个表达质粒算是构建成功了吗，直接线性化做表达的话会有什么影响吗？请各位高手指点。谢谢！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-05-19 10:23:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sweet561

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-21 14:36:14
pPIC9K的BamHI位点在α-signal sequence前面，整个质粒上还有几个和酶识别位点差一个碱基的位点，如果酶切条件不合适都可能切出来，如果酶切不完全质粒的超螺旋没去除干净也会出现条带，只要你用通用引物测序正确就 ...

哦，因为我的目的基因先是连在pPIC9上，然后再用BamHI和EcoRI将目的片段从pPIC9上切下，再连到pPIC9K上的，所以pPIC9K上切掉的信号肽，会跟目的基因连接后补上。
赞一下 回复此楼
8楼2014-05-21 16:37:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

rv1nm2y

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不放心的话测序看看。
赞一下 回复此楼
2楼2014-05-19 16:20:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是酶切酶连构建的重组质粒还是反向PCR构建的？你测序是用的通用引物还是自己的引物？如果是酶切酶连，测序用的通用引物那就没啥问题，杂带是酶切条件不好导致的非特异切割，不影响你的线性化。
还有pPIC9和你的基因大小差别太大，做双酶切验证效果很差，既然有PCR和测序验证，就不需要做酶切验证了。
赞一下(1人) 回复此楼
大家相互帮助哈
3楼2014-05-19 20:19:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sweet561

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-19 20:19:27
是酶切酶连构建的重组质粒还是反向PCR构建的？你测序是用的通用引物还是自己的引物？如果是酶切酶连，测序用的通用引物那就没啥问题，杂带是酶切条件不好导致的非特异切割，不影响你的线性化。
还有pPIC9和你的基因 ...

谢谢！只是我还要换酶切位点，再将目的基因转到pPIC9K里，之后pPIC9K-目的基因，也是用PCR、测序验证没问题，就是双酶切有另外一条非特异条带，是酶切酶连，而且是通用引物，就是害怕之后直接线性化会有问题。
赞一下 回复此楼
4楼2014-05-20 16:49:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 化工学硕294分，求导师收留 +33 yzyzx 2026-04-12 37/1850 2026-04-17 23:00 by wunaiy88
[考研] 304求调剂 +7 castLight 2026-04-16 7/350 2026-04-17 20:05 by 关一盏灯cd
[考研] 0854求调剂 +21 门路摸摸 2026-04-15 25/1250 2026-04-17 15:45 by qzxyhcsy
[论文投稿] 有没有接收比较快的sci期刊呀，最好在一个月之内的，研三孩子求毕业 20+4 之护着 2026-04-16 5/250 2026-04-17 10:02 by bobvan
[考研] 291求调剂 +9 关忆北. 2026-04-14 9/450 2026-04-16 22:49 by cfdbai
[考研] 291求调剂 +11 关忆北. 2026-04-14 11/550 2026-04-16 15:18 by jiahl2024
[考研] 297，工科调剂?河南农业大学本科 +14 河南农业大学-能 2026-04-14 14/700 2026-04-16 14:41 by dingyanbo1
[考研] 290调剂生物0860 +38 哇哈哈，。 2026-04-11 44/2200 2026-04-16 09:52 by cuisz
[考研] 279学硕食品专业求调剂院校 20+7 孤独的狼爱吃羊 2026-04-12 29/1450 2026-04-16 09:00 by screening
[考研] 求调剂推荐 +8 小聂爱学习 2026-04-14 8/400 2026-04-16 07:22 by 学员JpLReM
[考研] 297，工科调剂? +10 河南农业大学-能 2026-04-14 10/500 2026-04-15 21:50 by noqvsozv
[考研] 一志愿A区211，22408 321求调剂 +6 随心所欲☆ 2026-04-15 7/350 2026-04-15 21:45 by lbsjt
[考研] 085404 22408 309分求调剂 +9 lzmk 2026-04-14 10/500 2026-04-15 20:02 by 学员JpLReM
[考研] 各位老师好，求调剂，本科211，一志愿天津大学生物与医药学硕，差两名录取。 +11 路六六jjj 2026-04-13 11/550 2026-04-14 16:01 by zs92450
[考研] 366求调剂 +11 不知名的小卅 2026-04-11 11/550 2026-04-14 15:50 by zs92450
[考研] 0854调剂 +10 长弓傲 2026-04-11 11/550 2026-04-13 10:38 by wp06
[考研] 一志愿085802 323分求调剂 +13 drizzle_9 2026-04-12 14/700 2026-04-13 10:26 by Faiz5552
[考研] 一志愿浙大生物325分求调剂 +9 zysheng 2026-04-12 9/450 2026-04-12 22:31 by yuyin1233
[考研] 291求调剂 +8 关忆北. 2026-04-11 8/400 2026-04-12 09:32 by 逆水乘风
[考研] 359求调剂 +5 胃痉挛累了 2026-04-11 5/250 2026-04-11 19:55 by lbsjt
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭