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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切的目的基因与质粒连接不上怎么办
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sunyu65045

木虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切的目的基因与质粒连接不上怎么办 已有5人参与

我刚刚开始做分子克隆，将双酶切的基因片段大约1600bp与相同双酶切的质粒进行连接，电泳显示两个片段都很亮，酶切反应37摄氏度，2小时。使用T4 连接酶进行16摄氏度过夜连接，设置了阳性对照（仅含空质粒），在含有抗性的平板上进行涂布，结果阳性对照组长出很多菌落，而实验组几乎不长菌落，长出的菌落进行菌落PCR得到的条带也不是我所期望的，请大家帮帮忙，看我哪里出现了问题。
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1楼 2014-09-01 15:56:57
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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sunyu65045(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:21:32
载体加20*载体大小/（1000*浓度）ul
片段加100*片段大小/（1000*浓度）ul
再加酶，buffer，水，体系10ul。
16度过夜。
试试
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3楼2014-09-01 16:33:31
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caihang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
sunyu65045(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:21:24
刚开始连不上很正常。
1，连载体，片段与载体的比例非常重要。请依据跑胶时片段与载体的亮度，以及片段与载体的大小设计连接比例。
2，载体连接，运气成分占很大，看你人品了。
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2楼2014-09-01 16:28:04
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
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sunyu65045(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:21:43
设计引物的时候要注意选择的酶切位点的酶切效率，有些酶的酶切效率低需要添加保护性碱基或者延长酶切时间……楼上的连接的优化条件已经很好了，可以尝试一下！祝顺利！
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
4楼2014-09-01 17:17:45
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by sunyu65045 at 2014-09-02 18:08:41
质粒的亮度与marker最高亮度的条带差不多，在20微升里加入5~8微升，这个使用量算很多吗？...

那肯定是多了，我做连接10微升体系一般1微升，浓度高就加0.5微升或者更低。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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11楼2014-09-02 18:45:56
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by sunyu65045 at 2014-09-03 08:49:23
我的marker 最高亮度的条带DNA含量为20ng/uL，做连接时不是需要50~100ng吗，所以我在20微升里加入5~8uL，这样也多吗...

我没测过浓度，都是这么做的，也比较顺利。只是个参考，你可以尝试一下。祝你顺利！
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20楼2014-09-03 09:38:50
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普通回帖

wangtailin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:21:51
我刚做的一直连不上，首先查看质粒，第二盐浓度，当盐浓度较高时就连不上，我就用异丙醇和乙醇沉淀了下，除了下盐，效果不错，马上就连上了，我用的是pEASY_Blunt 质粒，最好
A260/230>=2.0,我的A260/230=1.8时阳性菌长了好多，1.5的就那么几个，所以建议先去测一下。。。
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学习着提升自己
5楼2014-09-01 18:57:41
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:22:05
连接体系是不是不合适？如果质粒很亮，就不需要加很多的。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2014-09-01 19:12:21
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Crocodile-YK

木虫 (正式写手)
调整片段和载体的比例！
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自然如此美丽！
7楼2014-09-01 19:55:17
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miclebibi

银虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-03 18:38:51
载体和片段的摩尔比为1:3
可以用NEB biocalculator计算
载体50-100ng为佳
如果不行，尝试TA克隆
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8楼2014-09-02 08:48:05
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111111111118

银虫 (正式写手)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-09-03 18:39:33
你好， 可以参考一下这个帖子：
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7727916
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9楼2014-09-02 13:41:45
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sunyu65045

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-09-01 19:12:21
连接体系是不是不合适？如果质粒很亮，就不需要加很多的。

质粒的亮度与marker最高亮度的条带差不多，在20微升里加入5~8微升，这个使用量算很多吗？
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10楼2014-09-02 18:08:41
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