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sunyu65045

木虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切的目的基因与质粒连接不上怎么办 已有5人参与

我刚刚开始做分子克隆,将双酶切的基因片段大约1600bp与相同双酶切的质粒进行连接,电泳显示两个片段都很亮,酶切反应37摄氏度,2小时。使用T4 连接酶进行16摄氏度过夜连接,设置了阳性对照(仅含空质粒),在含有抗性的平板上进行涂布,结果阳性对照组长出很多菌落,而实验组几乎不长菌落,长出的菌落进行菌落PCR得到的条带也不是我所期望的,请大家帮帮忙,看我哪里出现了问题。
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wangtailin

银虫 (小有名气)

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★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:21:51
我刚做的一直连不上,首先查看质粒,第二盐浓度,当盐浓度较高时就连不上,我就用异丙醇和乙醇沉淀了下,除了下盐,效果不错,马上就连上了,我用的是pEASY_Blunt 质粒,最好
A260/230>=2.0,我的A260/230=1.8时阳性菌长了好多,1.5的就那么几个,所以建议先去测一下。。。
学习着提升自己
5楼2014-09-01 18:57:41
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caihang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


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sunyu65045(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:21:24
刚开始连不上很正常。
1,连载体,片段与载体的比例非常重要。请依据跑胶时片段与载体的亮度,以及片段与载体的大小设计连接比例。
2,载体连接,运气成分占很大,看你人品了。
2楼2014-09-01 16:28:04
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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sunyu65045(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:21:32
载体加20*载体大小/(1000*浓度)ul
片段加100*片段大小/(1000*浓度)ul
再加酶,buffer,水,体系10ul。
16度过夜。
试试
3楼2014-09-01 16:33:31
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
sunyu65045(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:21:43
设计引物的时候要注意选择的酶切位点的酶切效率,有些酶的酶切效率低需要添加保护性碱基或者延长酶切时间……楼上的连接的优化条件已经很好了,可以尝试一下!祝顺利!
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
4楼2014-09-01 17:17:45
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