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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切的目的基因与质粒连接不上怎么办
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sunyu65045

木虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切的目的基因与质粒连接不上怎么办 已有5人参与

我刚刚开始做分子克隆，将双酶切的基因片段大约1600bp与相同双酶切的质粒进行连接，电泳显示两个片段都很亮，酶切反应37摄氏度，2小时。使用T4 连接酶进行16摄氏度过夜连接，设置了阳性对照（仅含空质粒），在含有抗性的平板上进行涂布，结果阳性对照组长出很多菌落，而实验组几乎不长菌落，长出的菌落进行菌落PCR得到的条带也不是我所期望的，请大家帮帮忙，看我哪里出现了问题。
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1楼 2014-09-01 15:56:57
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sunyu65045(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:21:32
载体加20*载体大小/（1000*浓度）ul
片段加100*片段大小/（1000*浓度）ul
再加酶，buffer，水，体系10ul。
16度过夜。
试试
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3楼2014-09-01 16:33:31
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caihang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
sunyu65045(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:21:24
刚开始连不上很正常。
1，连载体，片段与载体的比例非常重要。请依据跑胶时片段与载体的亮度，以及片段与载体的大小设计连接比例。
2，载体连接，运气成分占很大，看你人品了。
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2楼2014-09-01 16:28:04
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sunyu65045(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:21:43
设计引物的时候要注意选择的酶切位点的酶切效率，有些酶的酶切效率低需要添加保护性碱基或者延长酶切时间……楼上的连接的优化条件已经很好了，可以尝试一下！祝顺利！
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
4楼2014-09-01 17:17:45
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wangtailin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:21:51
我刚做的一直连不上，首先查看质粒，第二盐浓度，当盐浓度较高时就连不上，我就用异丙醇和乙醇沉淀了下，除了下盐，效果不错，马上就连上了，我用的是pEASY_Blunt 质粒，最好
A260/230>=2.0,我的A260/230=1.8时阳性菌长了好多，1.5的就那么几个，所以建议先去测一下。。。
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学习着提升自己
5楼2014-09-01 18:57:41
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