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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切怎么操作才能完全彻底呢！
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zhou325912

铜虫 (小有名气)

[求助] 双酶切怎么操作才能完全彻底呢！ 已有7人参与

我现在正在做双酶切连接，用的是NcoI和PstI这两个酶，首先我是将连有目的基因的质粒进行双酶切，然后将新的片段经双酶切之后连入目的载体（新片段和原来质粒上的片段大小一样，片段1.5kb，质粒剩下部分为6.8kb）转化有转化子，菌落PCR验证正确，但是拿了8个转化子提质粒测序之后发现全是之前的那个旧质粒，现在怀疑是质粒双酶切没有切完全，请问我应该怎么操作才能尽可能保证酶切完全呢
已经纠结了很长时间了，求大神指点
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1楼 2015-03-08 15:58:53
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去哪里看海

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-03-10 10:38:57
简单说就是没有连上对吧？我觉得可以从几个方面找原因，比如，片段与质粒的酶切是否充分，片段的浓度与回收状态，质粒的浓度，现在就是你的目的片段和被替代的片段大小一致，所以跑胶看不出来，如果菌批验证，那引物的设计有没有问题？不能P全长的。
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2楼2015-03-09 10:26:32
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意萧02

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-03-10 10:39:00
菌落PCR你用什么引物，不要用自己的引物，要用通用引物（至少用一头）。我以前试过，用 自己的引物可能得到验证条带大小对，但实际上是假的。
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3楼2015-03-09 11:22:47
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-03-10 10:39:04
双酶切之后先跑胶看看是否已经完全酶切，若没有就继续切，如完全切开了就低电压长时间跑胶，分离，回收再连接。
鉴定的时候，找一个目的片段里面有但原来那个1.5KB片段没有的酶切位点+载体上的酶切位点双酶切看看是否与自己分析的一致。一致就测序，不一致就错，不用PCR，麻烦。即使PCR，还是要酶切，麻烦。
是否看懂？
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4楼2015-03-09 16:52:16
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zhou325912

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2015-03-09 16:52:16
双酶切之后先跑胶看看是否已经完全酶切，若没有就继续切，如完全切开了就低电压长时间跑胶，分离，回收再连接。
鉴定的时候，找一个目的片段里面有但原来那个1.5KB片段没有的酶切位点+载体上的酶切位点双酶切看看是 ...

我懂，但是我的新的目的片段和1.5kb的片段只有几十个碱基不一样，所以后面鉴定的方法行不通。
我现在跑胶的时候清楚的只有两个条带，是不是就可以低电压跑时间久点回收尽可能的分离吧？
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5楼2015-03-09 20:53:13
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhou325912 at 2015-03-09 20:53:13
我懂，但是我的新的目的片段和1.5kb的片段只有几十个碱基不一样，所以后面鉴定的方法行不通。
我现在跑胶的时候清楚的只有两个条带，是不是就可以低电压跑时间久点回收尽可能的分离吧？...

嗯，那样分的开。如果那十几个碱基都没有酶切位点，就不太好验证了。

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6楼2015-03-10 00:43:41
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五维度的爱

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-03-10 10:39:09
可以把你酶切后的载体做个转化试下，看是否有菌落长出，这样可以验证下你的载体是否酶切完全了没
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7楼2015-03-10 10:06:35
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Lylissa

新虫 (初入文坛)
带有目的基因的质粒双酶切之后，需要跑胶将空载进行酶切回收，再与双酶切后的新片段进行连接。
如果菌落PCR验证之后是阳性结果，建议提取质粒后再进行酶切验证，与空载进行对比，可以知道片段到底是连没连上去。
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8楼2015-03-10 11:32:34
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Lylissa

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhou325912 at 2015-03-09 20:53:13
我懂，但是我的新的目的片段和1.5kb的片段只有几十个碱基不一样，所以后面鉴定的方法行不通。
我现在跑胶的时候清楚的只有两个条带，是不是就可以低电压跑时间久点回收尽可能的分离吧？...

想要将两条带跑开，与电压无关，电压只决定跑的速度，与胶浓度有关，胶浓度可以高一点，如1%变为1.5%，时间跑久点
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9楼2015-03-10 11:34:39
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zhou325912

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 意萧02 at 2015-03-09 11:22:47
菌落PCR你用什么引物，不要用自己的引物，要用通用引物（至少用一头）。我以前试过，用 自己的引物可能得到验证条带大小对，但实际上是假的。

引物是没有问题
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10楼2015-03-10 12:50:49
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