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zhou325912

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2015-03-10 00:43:41
嗯,那样分的开。如果那十几个碱基都没有酶切位点,就不太好验证了。
...

嗯,是的啊,所以很纠结
11楼2015-03-10 12:51:47
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zhou325912

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 五维度的爱 at 2015-03-10 10:06:35
可以把你酶切后的载体做个转化试下,看是否有菌落长出,这样可以验证下你的载体是否酶切完全了没

嗯,这个我试试
12楼2015-03-10 12:52:00
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zhou325912

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by Lylissa at 2015-03-10 11:34:39
想要将两条带跑开,与电压无关,电压只决定跑的速度,与胶浓度有关,胶浓度可以高一点,如1%变为1.5%,时间跑久点...

嗯,好的,谢谢
13楼2015-03-10 12:52:17
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zhou325912

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 去哪里看海 at 2015-03-09 10:26:32
简单说就是没有连上对吧?我觉得可以从几个方面找原因,比如,片段与质粒的酶切是否充分,片段的浓度与回收状态,质粒的浓度,现在就是你的目的片段和被替代的片段大小一致,所以跑胶看不出来,如果菌批验证,那引物 ...

引物设计是没有问题的,只是新片段和旧片段中间有部分序列不一样
14楼2015-03-10 12:54:46
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

为什么我觉得不合理……第一个质粒双酶切后,切胶回收目的条带,回收产物不含第一个质粒。然后切第二个质粒,空质粒直接回收,之前连着片段就切胶。最后把回收的片段和回收的第二个质粒做连接,无论如何也不可能出现第一个质粒啊。如果是第一个质粒本身大小和片段大小一样无法区分,那就不应该用双酶切,用pcr再测序就好了。

[ 发自小木虫客户端 ]
15楼2015-03-10 13:23:26
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意萧02

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by zhou325912 at 2015-03-10 12:50:49
引物是没有问题...

不是引物的问题,是不能用这个引物检测

[ 发自小木虫客户端 ]
16楼2015-03-10 13:41:07
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

新片段和旧片段中间不一样的部分序列有没有酶切位点?
17楼2015-03-10 15:46:35
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lxyyzz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhou325912(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-03-12 20:23:13
酶切第一个载体质粒时跑胶,然后选取切开的载体片段进行切胶回收,理论上就不会出现测序是原质粒的情况了。
如果想鉴定内切酶是否正常工作,可以设计对照实验:
未酶切质粒
内切酶1单酶切
内切酶2单酶切
观察这三组片段位置是否一样,切开后DNA呈线性,跟原始的超螺旋质粒肯定位置是不同的,如果两个单酶切都没有问题,那么双酶切理论上也不存在切除不完全的问题。
18楼2015-03-11 10:14:55
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zhou325912

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
17楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2015-03-10 15:46:35
新片段和旧片段中间不一样的部分序列有没有酶切位点?

这个没有。
19楼2015-03-11 16:58:56
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zhou325912

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
18楼: Originally posted by lxyyzz at 2015-03-11 10:14:55
酶切第一个载体质粒时跑胶,然后选取切开的载体片段进行切胶回收,理论上就不会出现测序是原质粒的情况了。
如果想鉴定内切酶是否正常工作,可以设计对照实验:
未酶切质粒
内切酶1单酶切
内切酶2单酶切
观察这 ...

恩,好的,我试一试。谢谢~
20楼2015-03-11 16:59:10
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