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zhou325912

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 意萧02 at 2015-03-10 13:41:07
不是引物的问题,是不能用这个引物检测
...

要是不用这对引物检测,那应该这么做才好?
21楼2015-03-11 17:02:37
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意萧02

木虫 (正式写手)

引用回帖:
21楼: Originally posted by zhou325912 at 2015-03-11 17:02:37
要是不用这对引物检测,那应该这么做才好?...

用测序通用引物,或者载体通用引物,你可以把你的引物做对照试试看结果怎么样。
22楼2015-03-11 17:36:32
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wshi85

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

做对照(单酶切,质粒),
酶切时间可考虑过夜,
酶切质粒量不用太多的,
电泳时间不能太短,一步步确保没问题,或者你载体弄没有同样大小的片段
很久没在虫虫上漂游了,觉得回归虫虫!
23楼2015-03-11 22:10:19
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chen振

铜虫 (初入文坛)

割胶回收吧 你那个几十个碱基菌落PCR是验证不了啊
fullpowerGS115
24楼2015-03-12 16:42:16
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Jatropha

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

不可能做到100%酶切的,很可能存在单酶切的情况,即使你的回收片段6.8Kb(完全酶切)和8.3Kb(单酶切)相差1.5Kb,切胶回收还是可能混在一起。
最有效的办法是在载体酶切时的同时加入去磷酸化的酶,比如Fermentas的是FastAP(货号,EF0651),酶切和去磷酸化同时完成。注意:质粒必须是过柱提取的,传统的溶液1,2,3提取,然后RNaseA消化的不可以,因为里面有太多的RNA小片段。
插入片段就不要去磷酸化了,切记。
25楼2015-03-13 17:03:38
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zhou325912

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
25楼: Originally posted by Jatropha at 2015-03-13 17:03:38
不可能做到100%酶切的,很可能存在单酶切的情况,即使你的回收片段6.8Kb(完全酶切)和8.3Kb(单酶切)相差1.5Kb,切胶回收还是可能混在一起。
最有效的办法是在载体酶切时的同时加入去磷酸化的酶,比如Fermentas的 ...

用生工的质粒试剂盒提的质粒,能不能去磷酸化处理?
26楼2015-03-13 18:09:49
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黄太帝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 意萧02 at 2015-03-09 11:22:47
菌落PCR你用什么引物,不要用自己的引物,要用通用引物(至少用一头)。我以前试过,用 自己的引物可能得到验证条带大小对,但实际上是假的。

自己的引物扩的产物为什么是假的?按理说目的片段就是自己特异引物扩增出来的,而通用引物并没有这种特异性。这里真没搞懂,求解。
做只快乐的小虫 快乐得学习
27楼2017-04-11 13:05:43
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黄太帝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 五维度的爱 at 2015-03-10 10:06:35
可以把你酶切后的载体做个转化试下,看是否有菌落长出,这样可以验证下你的载体是否酶切完全了没

即使长出了也有可能是载体自连,个人觉得该方法不妥。
做只快乐的小虫 快乐得学习
28楼2017-04-11 13:07:04
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