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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切怎么操作才能完全彻底呢！
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zhou325912

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 意萧02 at 2015-03-10 13:41:07
不是引物的问题，是不能用这个引物检测
...

要是不用这对引物检测，那应该这么做才好？
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21楼2015-03-11 17:02:37
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意萧02

木虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by zhou325912 at 2015-03-11 17:02:37
要是不用这对引物检测，那应该这么做才好？...

用测序通用引物，或者载体通用引物，你可以把你的引物做对照试试看结果怎么样。
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22楼2015-03-11 17:36:32
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wshi85

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

做对照（单酶切，质粒），
酶切时间可考虑过夜，
酶切质粒量不用太多的，
电泳时间不能太短，一步步确保没问题，或者你载体弄没有同样大小的片段
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很久没在虫虫上漂游了，觉得回归虫虫！
23楼2015-03-11 22:10:19
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chen振

铜虫 (初入文坛)
割胶回收吧 你那个几十个碱基菌落PCR是验证不了啊
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fullpowerGS115
24楼2015-03-12 16:42:16
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Jatropha

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

不可能做到100%酶切的，很可能存在单酶切的情况，即使你的回收片段6.8Kb（完全酶切）和8.3Kb（单酶切）相差1.5Kb，切胶回收还是可能混在一起。
最有效的办法是在载体酶切时的同时加入去磷酸化的酶，比如Fermentas的是FastAP（货号，EF0651），酶切和去磷酸化同时完成。注意：质粒必须是过柱提取的，传统的溶液1,2,3提取，然后RNaseA消化的不可以，因为里面有太多的RNA小片段。
插入片段就不要去磷酸化了，切记。
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25楼2015-03-13 17:03:38
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zhou325912

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by Jatropha at 2015-03-13 17:03:38
不可能做到100%酶切的，很可能存在单酶切的情况，即使你的回收片段6.8Kb（完全酶切）和8.3Kb（单酶切）相差1.5Kb，切胶回收还是可能混在一起。
最有效的办法是在载体酶切时的同时加入去磷酸化的酶，比如Fermentas的 ...

用生工的质粒试剂盒提的质粒，能不能去磷酸化处理？
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26楼2015-03-13 18:09:49
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黄太帝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 意萧02 at 2015-03-09 11:22:47
菌落PCR你用什么引物，不要用自己的引物，要用通用引物（至少用一头）。我以前试过，用 自己的引物可能得到验证条带大小对，但实际上是假的。

自己的引物扩的产物为什么是假的？按理说目的片段就是自己特异引物扩增出来的，而通用引物并没有这种特异性。这里真没搞懂，求解。
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做只快乐的小虫 快乐得学习
27楼2017-04-11 13:05:43
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黄太帝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 五维度的爱 at 2015-03-10 10:06:35
可以把你酶切后的载体做个转化试下，看是否有菌落长出，这样可以验证下你的载体是否酶切完全了没

即使长出了也有可能是载体自连，个人觉得该方法不妥。
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做只快乐的小虫 快乐得学习
28楼2017-04-11 13:07:04
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