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zhou325912

铜虫 (小有名气)

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16楼: Originally posted by 意萧02 at 2015-03-10 13:41:07
不是引物的问题，是不能用这个引物检测
...

要是不用这对引物检测，那应该这么做才好？

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21楼2015-03-11 17:02:37

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意萧02

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21楼: Originally posted by zhou325912 at 2015-03-11 17:02:37
要是不用这对引物检测，那应该这么做才好？...

用测序通用引物，或者载体通用引物，你可以把你的引物做对照试试看结果怎么样。

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22楼2015-03-11 17:36:32

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wshi85

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

做对照（单酶切，质粒），
酶切时间可考虑过夜，
酶切质粒量不用太多的，
电泳时间不能太短，一步步确保没问题，或者你载体弄没有同样大小的片段

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很久没在虫虫上漂游了，觉得回归虫虫！

23楼2015-03-11 22:10:19

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chen振

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割胶回收吧你那个几十个碱基菌落PCR是验证不了啊

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fullpowerGS115

24楼2015-03-12 16:42:16

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Jatropha

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【答案】应助回帖

不可能做到100%酶切的，很可能存在单酶切的情况，即使你的回收片段6.8Kb（完全酶切）和8.3Kb（单酶切）相差1.5Kb，切胶回收还是可能混在一起。
最有效的办法是在载体酶切时的同时加入去磷酸化的酶，比如Fermentas的是FastAP（货号，EF0651），酶切和去磷酸化同时完成。注意：质粒必须是过柱提取的，传统的溶液1,2,3提取，然后RNaseA消化的不可以，因为里面有太多的RNA小片段。
插入片段就不要去磷酸化了，切记。

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25楼2015-03-13 17:03:38

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zhou325912

铜虫 (小有名气)

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25楼: Originally posted by Jatropha at 2015-03-13 17:03:38
不可能做到100%酶切的，很可能存在单酶切的情况，即使你的回收片段6.8Kb（完全酶切）和8.3Kb（单酶切）相差1.5Kb，切胶回收还是可能混在一起。
最有效的办法是在载体酶切时的同时加入去磷酸化的酶，比如Fermentas的 ...

用生工的质粒试剂盒提的质粒，能不能去磷酸化处理？

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26楼2015-03-13 18:09:49

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